共查询到18条相似文献，搜索用时 640 毫秒
1.
[目的]探讨猪圆环病毒2型(PCV2)感染量、感染时间与被感染RAW264.7细胞活性氧水平动态变化的相关性,为建立RAW264.7细胞氧化胁迫体外模型提供参考依据.[方法]PCV2原液调至5×106/mL,经10、102、103和104倍稀释(10-1、10-2、10-3和10-4释度)后,感染作用RAW264.7细胞2h,弃病毒液,加入含5% FBS的DMEM培养液继续培养,分别于第4、8、12、24和48 h收集细胞上清液或细胞,测定一氧化氮(NO)、活性氧自由基(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、黄嘌呤氧化酶(XOD)、髓过氧化物酶(MPO)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)等指标.[结果]10-1PCV2感染RAW264.7细胞后能有效升高细胞NO、ROS水平,降低细胞GSH水平和GSH/GSSG,升高细胞XOD、MPO和iNOS活性,表明以10-1pcv2感染RAW264.7细胞一定程度上能改变细胞氧化还原状态,诱导细胞产生氧化应激.[结论]PCV2感染能诱导RAW264.7细胞发生氧化应激,并确立10-1 PCV2(5× 105/mL)体外感染RAW264.7细胞4~24 h是建立RAW264.7细胞氧化胁迫模型的最佳条件. 相似文献
2.
为探讨牛分枝杆菌TB10.4蛋白与RAW264.7细胞的相互作用关系,表达纯化了rTB10.4,并采用IFN-γ释放试验和Western blot检测其细胞活性。使用不同剂量rTB10.4与RAW264.7细胞共孵育后,采用实时无标记动态细胞分析技术检测rTB10.4对RAW264.7细胞生长影响的最佳时间点和最佳剂量。在此基础上,采用量化流式细胞仪分析重组蛋白rTB10.4对RAW264.7细胞TLR2表达的影响。结果表明,获得的rTB10.4具有较强的T细胞和B细胞活性,rTB10.4对RAW264.7细胞的作用呈剂量依赖性,作用起效时间为12~24h,诱导作用在16~18h达到最大效应值。量化流式分析仪分析结果表明,rTB10.4刺激可显著增强RAW264.7细胞的细胞膜上TLR2的表达。 相似文献
3.
[目的]探讨山豆根多糖(SSP)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染RAW264.7细胞存活率及分泌炎性因子水平的影响,为研发出治疗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的新型兽药提供参考依据.[方法]以50、100、200和400 μg/mL SSP作用于PRRSV体外感染8h的RAW264.7细胞,通过MTT法评价SSP对PRRSV感染RAW264.7细胞存活率,ELISA检测SSP对PRRSV体外感染RAW264.7细胞培养上清液中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1.[结果]PRRSV感染RAW264.7细胞8h极显著降低了细胞存活率(P<0.01,下同),而200~400 μg/mL SSP能极显著升高PRRSV感染RAW264.7细胞存活率.PRRSV感染RAW264.7细胞8h可极显著升高细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1水平,而SSP能有效降低PRRSV感染RAW264.7细胞分泌上述炎性因子水平,其中以200~400μg/mL SSP的抑制效果最佳.[结论]SSP通过提高炎症细胞存活率及抑制其分泌炎性因子水平,从而有效干预PRRSV感染免疫细胞的炎性反应. 相似文献
4.
[目的]明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)感染过程中的免疫作用,为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考.[方法]以多子小瓜虫感染草鱼后,采用实时荧光定量PCR检测分析在不同时间点(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草鱼部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化.[结果]草鱼感染多子小瓜虫后,TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮肤和脾脏中的表达主要呈上调趋势,TLR4基因在皮肤中主要呈上调表达,在脾脏中则主要呈下调表达;TLR信号通路接头蛋白基因MyD88和TRIF的表达变化趋势明显不同,其中,MyD88基因的表达在感染后第1~3 d均呈显著上调趋势(P<0.05,下同),而TRIF基因的表达在整个试验过程中绝大多数时间点与对照组无显著差异(P>0.05);IRAK4和IRAK1在皮肤和脾脏中的表达也主要呈上调趋势,但在脾脏中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表达呈显著下调趋势;IL-1β和TNF-α在绝大多数时间点均显著上调,但IFN的表达基本没有变化.[结论]草鱼TLR信号通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及下游细胞因子(IL-1β和TNF-α)均参与防御多子小瓜虫感染的免疫反应,尤其是在感染早期和中期发挥关键作用. 相似文献
5.
[目的]构建牛TLR2全长基因表达质粒,并在HEK293细胞中表达。[方法]利用RT-PCR技术克隆TLR2基因的全长编码区,连接到pMD18-Tsimplevector,再亚克隆到pEGFP-N1载体,得到包含TLR2基因全长的重组真核表达质粒。将重组质粒瞬时转染到HEK293细胞。流式细胞计数法和共聚焦显微镜法检测转染效率和表达蛋白在细胞中的定位;qRT-PCR法检测TLR2 mRNA在HEK293/boTLR2中的表达。最后,通过脂膜酸刺激HEK293/boTLR2细胞试验来分析TLR2蛋白的生物活性。[结果]成功克隆TLR2基因全长并连接到真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。在LTA刺激的条件下,转染重组质粒的细胞比未转染的HEK293细胞分泌更多IL-8。[结论]本研究建立的细胞模式为TLR激动剂和拮抗剂的筛选提供快速有效的手段,有利于开展TLR激动剂和TLRs相互作用的研究。 相似文献
6.
【目的】探讨猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染对小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）炎症反应的影响,确定PRV的最佳感染剂量和感染时间,为建立RAW264.7细胞体外病毒感染炎症反应模型打下基础。【方法】PRV按10倍递增稀释成10-5~10-1 PRV稀释液,感染RAW264.7细胞并孵育1.5 h,弃病毒液后加入含5%胎牛血清的DMEM维持培养液继续培养,分别于继续培养2、4、8、12、24和48 h时收集细胞上清液,采用ELISA测定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及环氧合酶（COX-1和COX-2）活性,并以CCK-8法测定细胞活性。【结果】以PRV感染RAW264.7细胞4~48 h后均能通过PCR扩增获得PRV核酸的特异性条带,故选择4~48 h作为后续研究的PRV感染时间范围;10-2 PRV~10-1 PRV感染可显著降低RAW264.7细胞活性（P<0.05,下同）,10-3 PRV组仅在培养48 h时出现下降趋势,而10-5 PRV~10-4 PRV感染对RAW264.7细胞活性无显著影响。PRV感染RAW264.7细胞后,其胞内炎症因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整体上呈升高趋势,其中10-3 PRV感染RAW264.7细胞12 h能显著或极显著（P<0.01）提高IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平;10-4 PRV~10-1 PRV感染组的IL-10分泌水平均呈升高趋势,而10-5 PRV感染组在感染8和24 h时IL-10分泌水平明显低于空白对照组,至感染48 h所有病毒感染组的IL-10分泌水平均降低;10-3 PRV~10-1 PRV感染8~24 h能有效提高RAW264.7细胞的COX-2活性,但对COX-1活性的影响不明显。【结论】PRV感染能诱导RAW264.7细胞发生炎症反应,其中10-3 PRV体外感染RAW264.7细胞8~12 h是建立RAW264.7细胞炎症反应模型的最佳条件。该模型可应用于PRV感染与RAW264.7细胞炎症反应相关干预药物的研究,为进一步揭示PRV感染机理及开发抗病毒感染药物提供理论依据。 相似文献
7.
《内蒙古农业大学学报(自然科学版)》2014,(2)
目的:研究益生菌L.Casei Zhang对巨噬细胞RAW264.7中NO/iNOS表达的影响及探讨相关机制。方法:1×10~6CFU益生菌L.Casei Zhang与巨噬细胞RAW264.7细胞共培养2h,6h,12h,24h。收集细胞培养上清,检测NO的表达变化。通过Real-rime PCR检测iNOS、TLR2和TLR4表达的变化。L.Casei Zhang与RAW264.7共培养3h后,以LPS、CpG和PolyI:C刺激细胞,检测NO和iNOS表达的变化。结果:益生菌L.Casei Zhang促进了巨噬细胞中NO分泌和iNOS的表达。与TLR2的本底表达相比,L.Casei Zhang上调了RAW264.7细胞中TLR2的表达。TLR4 mRNA的表达在L.Casei Zhang与RAW264.7细胞共培养后2h显著增高。LPS和PolyI:C活化的巨噬细胞在L.Casei Zhang预处理后,NO/iNOS的表达水平显著降低。结论:益生菌L.Casei Zhang促进巨噬细胞中NO/iNOS的表达与促进TLR2和TLR4的表达有关。L.Casei Zhang抑制了LPS和PolyI:C诱导的巨噬细胞中NO/iNOS的表达。该研究为进一步阐明益生菌的免疫调节作用奠定了基础。 相似文献
8.
为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。 相似文献
9.
[目的]构建含G FP-LC3B基因的真核表达载体.[方法]从HEK293细胞中提取总RNA,以反转录得到cDNA为模板,根据Gen Bank公布的人源LC3B基因序列设计引物,通过PCR方式扩增目的基因,将基因和pcDNA3.1-GFP载体双酶切后,通过T4连接酶将基因连接到pcDNA3.1-GF载体上,得到cDNA3.1-GFP-LC3B真核表达载体.[结果]扩增出目的基因,构建了含目的基因的真核表达载体cDNA3.1-GFP-LC3B.[结论]成功构建了含有人LC3B基因的真核表达载体pcDNA3.1-GFP-LC3B,为研究细胞自噬提供了基础. 相似文献
10.
[目的]通过构建靶向14-3-3ξ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒.[方法]设计靶向14-3-3ξ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果.从psiRNA质粒上扩增H1-si￡基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlul酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达.[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功.病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装.[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ξ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3￡相关的体内、外研究提供了试验基础. 相似文献
11.
[目的]探讨γ-亚麻酸（GLA）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞产生炎症介质的影响及其机制。[方法]采用体外培养的巨噬细胞系RAW264.7细胞,待细胞生长至融合状态后加入不同浓度（0、12.5、25、50μmol/L）的GLA预孵4h,利用100ng/ml的脂多糖（LPS）刺激12h或0.5h,同时设空白对照和LPS对照,利用蛋白印迹法检测诱生型一氧化氮合酶（iNOS）、环加氧酶-2（COX-2）蛋白的表达以及对IκBα、p-JNK/SAPK（Thr183/Tyr185）、p38MAPK、p-p38MAPK（Thr180/Tyr182）、ERK1/2、p-ERK1/2的影响。[结果]GLA可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的蛋白表达（P〈0.05）,且在0～50μmol/LGLA浓度范围内存在剂量依赖关系。GLA可以显著抑制IκBα的降解（P〈0.05）,从而抑制NF-κB的激活。GLA可以显著抑制LPS诱导的JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化（P〈0.05）,对p38的磷酸化没有显著的影响。[结论]GLA具有很好的消炎功效。抑制JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化、抑制NF-κB的激活可能是其发挥生物学效应的重要机制。 相似文献
12.
13.
[目的]探讨γ-亚麻酸（GLA）对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞产生炎症介质的影响及其机制。[方法]以体外培养的巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,待细胞生长至融合状态后加入不同浓度（0、12.5、25、50μmol/L）的GLA预孵4 h,利用100 ng/m l的脂多糖（LPS）刺激12.0 h或0.5 h,同时设空白对照和LPS对照,利用蛋白印迹法检测诱生型一氧化氮合酶（iNOS）、环加氧酶-2（COX-2）蛋白的表达以及对IκBα、p-JNK/SAPK（Thr183/Tyr185）、p38 MAPK、p-p38 MAPK（Thr 180/Tyr182）、ERK1/2、p-ERK1/2的影响。[结果]GLA可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX-2的蛋白表达（P〈0.05）,且在0~50μmol/L GLA浓度范围内存在剂量依赖关系。GLA可以显著抑制IκBα的降解（P〈0.05）,从而抑制NFκ-B的激活。GLA可以显著抑制LPS诱导的JNK1/2以及ERK1/2的磷酸化（P〈0.05）,对p38的磷酸化没有显著影响。[结论]GLA具有很好的消炎功效。抑制JNK1/2和ERK1/2的磷酸化、抑制NF-κB的激活可能是GLA发挥生物学效应的重要机制。 相似文献
14.
[目的]通过血清药理学方法,研究头花蓼不同提取物及热淋清颗粒含药血清对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)释放炎症因子的影响,筛选出头花蓼抗炎有效提取物。[方法]采用头花蓼血清药理学评价方法,10 ng/m L脂多糖(LPS)建立RAW264.7细胞炎症损伤模型,MTT法检测细胞存活率,Griess试剂法检测细胞上清液中NO的释放量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中TNF-α和IL-6的释放量,以考察头花蓼水提物、水提醇沉提取物、水提醇沉沉淀物及热淋清颗粒含药血清(WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS)对巨噬细胞释放炎症因子的影响。[结果]与模型组比较,WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS均能显著抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞释放炎症因子NO、TNF-α和IL-6,PCWEPS组抑制细胞释放NO、TNF-α和IL-6的作用最强。[结论]头花蓼水提醇沉提取物为头花蓼主要的抗炎有效提取物。 相似文献
15.
[目的]探讨miR-155在脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应中的表达及糖皮质激素(GCs)的干预影响。[方法]体外培养RAW 264.7巨噬细胞,分别用浓度为10.0、1.0、0.1μg/ml LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞,于2、6、12、24、36 h 5个时间点收集上清用ELISA检测白介素-6(IL-6)蛋白浓度;实时定量-PCR检测miR-155在2、6、12、36 h 4个时间点的表达变化。[结果]IL-6在各浓度LPS处理组、各时间点其含量均高于对照组(CK);miR-155的表达在各时间点LPS组均高于LPS+GCs和CK。[结论]LPS可以诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应,炎症反应时miR-155高表达,糖皮质激素可抑制miR-155的表达。 相似文献
16.
为了建立最优的巨噬细胞RAW264.7培养方法和电转染条件,在细胞培养时采用两种方法了解细胞的培养特性并进行电转染条件的优化,建立并验证RAW264.7细胞快速、无血清培养体系的电转染方法。以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,进一步优化巨噬细胞电穿孔的条件。通过控制电压(250~420 V)、脉冲时间、电击次数、温度、电击缓冲液等转染条件,采用不同的条件组合,用电穿孔法将质粒pEGFP-C1转染于培养的RAW 264.7细胞。通过荧光显微镜分析转染效率,可见:用胰酶和细胞刮刀消化RAW264.7细胞,细胞损伤小,形态好。利用优化的电转染条件得出最佳转染条件是:电压350 V、脉冲时间30 ms、电击1次、电击缓冲液成分为cell盐和options且V(cell盐)∶V(options)=3∶1、最佳温度4℃。 相似文献
17.
[目的]研究IFN-α2b与狂犬病纯化疫苗对小白鼠的保护效果。[方法]将IFN-α2b与狂犬病纯化疫苗按不同的免疫程序应用于6个试验组中。1组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,0、37、1、4 d免疫;2组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,同时腹腔注射IFN-α2b 1 500IU/只,0、3、71、4 d免疫;3:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,0、37、d免疫;4组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,同时腹腔注射IFN-α2b1 500 IU/只,03、7、d免疫;5组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,03、、71、4 d免疫,于0、12、d腹腔注射IFN-α2b 1 500 IU/只;6组:狂犬病疫苗腹腔注射0.5 ml/只,0、3、71、4 d免疫,于0、12、、37、1、4 d腹腔注射IFN-α2b 1 500 IU/只。34、组于第9天攻击,12、、56、组于第21天攻击后计算其保护率。[结果]狂犬病疫苗与IFN-α2b联合应用组其保护率明显高于其他组,且按免疫程序同时应用IFN-α2b组其保护率最高。[结论]按狂犬病疫苗免疫程序同时应用IFN-α2b组其免疫效果最好,保护率最高。而提前应用IFN-α2b并没有增强狂犬病疫苗的保护率。 相似文献
18.
[目的]建立具有绿色荧光标记的表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系。[方法]从BL21（DE3）大肠杆菌中克隆出T7RNAP基因,定向克隆进质粒FG12后,构建了表达T7RNA聚合酶基因（T7）的Lenti-virus重组质粒FG12-T7RNAP。用此重组质粒转染293T细胞,WB可检测出瞬时表达的T7RNAP蛋白;利用辅助质粒对表达T7的非复制型Lenti-virus病毒进行体外包装,所获得的非复制型Lenti-virus病毒感染BHK-21细胞,利用GFP通过流式细胞分选仪筛选表达T7的细胞系,并利用WB检测基因的表达。[结果]通过WB检测出不同代次的阳性细胞中均能稳定表达目的基因T7RNA聚合酶。[结论]T7RNA聚合酶能顺利在真核细胞内表达,并在此基础上建立的稳定细胞系为RNA病毒体内拯救技术平台的建立奠定了基础。 相似文献