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小麦叶片蛋白质组的2D-LC分离及Nano LC-MS/MS分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】二维液相色谱（2D-LC）与双向电泳（2-DE）技术具有互补性,本文旨在探讨利用2D-LC和纳升级液相色谱串联质谱（Nano LC-MS/MS）技术分离鉴定小麦叶片蛋白质组的新方法。【方法】小麦叶片蛋白经提取、脱盐后,进行第一维阴离子交换分离;收集洗脱组分进行SDS-PAGE分析,并对非高丰度蛋白组分进行第二维反相液相色谱分离;随机选择含较低吸收峰的部分组分经胰蛋白酶水解后进行Nano LC-MS/MS 分析;将串联质谱数据通过MASCOT搜索NCBInr和EST数据库,并对二级质谱获得的蛋白序列进行MS BLAST分析。【结果】经第一维阴离子交换色谱分离,收集得到15个组分,其中第15组分包含小麦叶片丰度最高的蛋白——1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCO）;其余14个组分经反相液相色谱分离,共收集1 551个组分,获得1 867个色谱峰;随机对其中6个含较低吸收峰的收集组分酶解和Nano LC-MS/MS 检测,9种蛋白得到鉴定。【结论】结果初步表明,利用2D-LC和Nano LC-MS/MS技术可有效地分离和鉴定小麦叶片蛋白质组,为更深入全面地研究小麦叶片蛋白质组奠定基础。 相似文献
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中国3个主栽烟草品种的差异蛋白质组学研究 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】从全蛋白质组学水平研究烟草,筛选具有重要特性的蛋白质,阐明其相关代谢通路,使得烟草的基础科学研究和品种培育工作有所突破。【方法】利用苯酚法提取中国3个主栽烟草品种红花大金元、K326和云烟87叶片的蛋白质,酶解后采用串联质量标签技术(tandem mass tag,TMT)标记,结合二维液相色谱串联质谱技术(2D LC-MS/MS)对3个烟草品种叶片的蛋白质组成进行分析,运用Proteome Discoverer软件提取谱图后在MASCOT搜索引擎上鉴定蛋白质和肽段,并对鉴定的蛋白质进行系统的生物信息学分析,包括数据相关性分析、分层聚类分析和主成分分析,同时按照2倍上下调的原则采用火山图筛选不同品种烟草中表达差异显著的蛋白质,最后利用KEGG通路分析烟草中重要蛋白质的分布及功能。【结果】鉴定红花大金元、K326和云烟87烟草样品的蛋白质Group总数为3 079,蛋白质ID数为10 343。从分层聚类分析和主成分分析中蛋白质的整体表达情况可见,K326和云烟87蛋白质表达情况较相似,而红花大金元与前两者相差较大。后续的差异蛋白质筛选也验证了该结果,表现为云烟87和K326之间仅存在29个差异表达的蛋白质,其中13个蛋白质覆盖8条代谢通路,包括类黄酮生物合成,参与类黄酮合成路径的查尔酮合成酶在K326中的相对含量显著高于云烟87。红花大金元和云烟87之间有160个蛋白质差异表达,其中103个蛋白质覆盖42条代谢通路,包括谷胱甘肽代谢,相对定量结果显示谷胱甘肽代谢途径相关的3种酶,谷胱甘肽过氧化物酶、磷脂过氧化氢物谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽S-转移酶在红花大金元中的含量均显著低于云烟87。红花大金元和K326之间存在119个差异蛋白质,其中89个蛋白质覆盖41条代谢通路,包括外源物质细胞色素P450代谢。筛选获得的重要差异蛋白质的相对定量结果显示一些与抗性相关的蛋白质,如蛋白酶抑制剂,在云烟87中的表达量远低于K326和红花大金元,同时结果表明红花大金元中的超氧化物歧化酶含量处于较低水平。【结论】TMT技术结合2D LC-MS/MS可对不同品种烟草的叶片蛋白质进行有效地分离和鉴定,鉴定出的蛋白质大部分是参与光合作用、物质代谢或者与抗逆性相关。 相似文献
3.
【目的】苹果着色是一个重要的质量性状,构建苹果磷酸化蛋白质组并进行鉴定与分析,了解在苹果着色过程中的蛋白质磷酸化,为进一步阐明苹果着色机理提供参考。【方法】以着色‘嘎拉’和非着色‘金冠’两个品种苹果果皮为试材提取总蛋白,用TiO2富集磷酸化肽段,对富集到的磷酸化肽段进行高效液相色谱分离,利用质谱鉴定磷酸化肽段,采用Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4（thermo）软件进行蛋白质查库鉴定,使用的数据库为Uniprot_Maloideae.fasta。对鉴定到的磷酸化肽段和蛋白质进行分析,找出着色与非着色苹果品种中有差异的磷酸化蛋白质及其修饰位点。【结果】在着色苹果品种中鉴定到1 323个蛋白质、3 339个肽段和225个磷酸化肽段,发现磷酸化蛋白质约200-225种;在非着色苹果品种中鉴定到569个蛋白质、1 152个肽段和128个磷酸化肽段,发现磷酸化蛋白质约117-128种。比较分析表明,43个磷酸化肽段仅在非着色苹果品种中发现,139个磷酸化肽段仅在着色苹果品种中发现,在着色苹果品种中有更多的蛋白质发生了磷酸化,其中质膜H+-ATPase在两个苏氨酸位点发生磷酸化,过敏原蛋白和两个蛋白激酶在丝氨酸位点发生磷酸化,3个转录因子、1个钾转运蛋白和1个受体激酶都发生磷酸化。在两个苹果品种鉴定出的蛋白质中,发生蛋白质磷酸化的位点主要是丝氨酸,其次是苏氨酸,在酪氨酸位点发生蛋白质磷酸化很少。蛋白质WD40和花青苷合成途径中的相关酶蛋白C4H、4CL、CHS、CHI、F3′H、FLS、LDOX和UFGT在着色过程中未发生磷酸化。在着色和非着色苹果品种中都存在MYBR转录因子,并且都发生了蛋白质磷酸化。【结论】在着色苹果品种中产生了一些特有的磷酸化蛋白质,其中包括已知与着色相关的质膜H+-ATPase,苹果着色可能受到蛋白质磷酸化的影响。 相似文献
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【目的】研究采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术检测蛋白质分子量的优化条件。【方法】选择3种不同的基质检测牛血清白蛋白（BSA）的分子量,在选定最佳基质化合物的基础上,通过改变样品蛋白质的浓度,以获得高质量的质谱峰图,确定蛋白质样品的最小和最优检测量。【结果】1 μg蛋白质样品与10 mg/mL含0.1%乙酸（TFA）和50%乙腈（ACN）的芥子酸（SA）基质水溶液混合检测分子量,可产生最高质量的MALDI-TOF-MS峰图,同时蛋白质样品最小检测量应不少于500 ng。【结论】MALDI-TOF-MS技术操作简单、分析快速、灵敏度高,是一种检测蛋白质分子量的可靠方法;研究结果确定了获得最优化质谱峰的最佳组合,这是从高度复杂的蛋白质样品测定准确分子量的必备条件。 相似文献
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蛇龙珠葡萄酒酒龄花青素高效液相色谱（HPLC）指纹图谱研究 总被引：12，自引：0，他引：12
【目的】建立葡萄酒酒龄花青素HPLC指纹图谱，区分鉴定不同酒龄（年份）蛇龙珠葡萄酒。【方法】HPLC检测：采用反相C18柱，调整流动相pH 1.6，二元梯度洗脱，检测波长518 nm。指纹图谱建立方法：计算HPLC色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，按相对保留时间排列相对应的相对峰面积，并编号。【结果】利用14个主要的色谱峰建立了蛇龙珠葡萄酒酒龄花青素HPLC指纹图谱，并根据资料对葡萄酒各色谱峰成分进行了初步的定性鉴定。利用HPLC方法分离出14号峰，该峰显著影响葡萄酒酒龄花青素指纹图谱。随酒龄的增加色谱峰相对面积出现显著变化。6个不同酒龄（年份）葡萄酒的花青素指纹图谱明显不同。【结论】试验结果稳定，效果好；花青素HPLC指纹图谱可以区分不同酒龄葡萄酒，是区分鉴定葡萄酒酒龄可行的方法。 相似文献
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【目的】分析巴西橡胶树（Hevea Brasiliensis Müll.Arg.）橡胶粒子的蛋白质构成,探索未知的橡胶粒子蛋白质。【方法】采用16-BAC/SDS PAGE双向电泳分离橡胶粒子蛋白质,采用MALDI/TOF-TOF质谱技术进行蛋白质鉴定;此外,利用磺基异硫氰酸苯酯（SPITC）化学辅助质谱测序法进行肽段的从头测序,获得未知蛋白质肽段的氨基酸序列。通过搜索橡胶树胶乳转录组测序获得的EST数据库,获取已知部分氨基酸序列蛋白质的全序列,或通过部分肽段获取为未知蛋白质编码的EST序列。【结果】获得了橡胶粒子蛋白质的16-BAC/SDS-PAGE双向电泳图谱,鉴定了17个橡胶粒子蛋白质;获得1个小橡胶粒子蛋白（small rubber particle protein,SRPP）亚家族成员SRPP(gi|37622210)的完整氨基酸序列以及1个橡胶延伸因子（rubber elongation factor,REF）亚家族新成员(hbREF2)的C端87个氨基酸残基序列,此蛋白质的氨基酸序列与已知的REF(gi|38122474)具有高度的相似性。【结论】采用16-BAC/SDS-PAGE双向电泳有效地分离了橡胶粒子蛋白质,展现了橡胶粒子蛋白质的相对含量,研究结果表明构成橡胶粒子的主要蛋白质组分是REF和SRPP亚家族蛋白质。橡胶粒子的蛋白质组分的全面鉴定,将有助于揭示橡胶粒子的生物学功能。 相似文献
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【目的】探索适合宁夏枸杞果实细胞壁蛋白提取方法,为后续进行宁夏枸杞蛋白质组学研究提供技术支持。【方法】以宁夏枸杞果实为试验材料,采用六步洗脱法去除胞浆蛋白,然后通过定量和电泳比较氯化钙提取法、氯化锂提取法、氯化钙加氯化锂结合提取法和苯酚提取法对细胞壁蛋白的提取效果,通过双向电泳与液相色谱对所得细胞壁蛋白进行验证。【结果】六步洗脱法可较好地除去胞浆蛋白与其他干扰物质,4种方法对宁夏枸杞果实细胞壁蛋白的提取效果排序为:氯化钙提取法（272μg/g）>苯酚提取法（261μg/g）>氯化钙加氯化锂结合提取法（217μg/g）>氯化锂提取法（176μg/g）。裂解液I[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、30 g/L 3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、50 g/L二硫苏糖醇（DTT）]溶解蛋白质效果更优,蛋白质定量浓度更高、电泳条带更多、更清晰。氯化钙提取所得蛋白质样品双向电泳结果较好,蛋白质点数较多、清晰度和分辨率较高;通过液相色谱可看出氯化钙提取的细胞壁蛋白肽段种类多,且大部分相对丰度较高,并含有低丰度蛋白质。所测蛋白质分类中有细胞壁定位的蛋白质。【结论】氯化钙单独提取蛋白质样品的方法是宁夏枸杞果实细胞壁蛋白提取最优方法,所得蛋白质样品已达到进行蛋白质组学研究的标准。 相似文献
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快速检测大豆籽粒中十二种异黄酮组分的HPLC方法 总被引：4，自引：2，他引：2
【目的】利用高效液相色谱（HPLC）技术快速检测大豆异黄酮组分,为大豆的异黄酮标记辅助育种提供重要依据。【方法】以大豆异黄酮12种组分为标准样品,利用HPLC技术结合吸收波峰鉴定的方法进行异黄酮组分的分析。【结果】不同异黄酮苷元组分黄豆苷元（daidzein）、大豆黄素(glycitein)和染料木素(genistein）分别具有不同的最大紫外光谱吸收波长,分别位于250、257和260 nm左右。采用YMC-C18反相色谱柱,以含0.1%（v/v）乙酸13%～30%（v/v）的乙腈为流动相,在35℃柱温条件下,经梯度洗脱,结合紫外吸收检测,可以准确地定性和定量鉴定出12种不同异黄酮组分。【结论】该方法样品用量少,检测异黄酮含量准确、快速,适合大量样本分析。 相似文献
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采用相对和绝对定量同位素标签（iTRAQ）对蛋白质进行鉴定和比较定量,其能进一步比较更为复杂样品的蛋白质表达水平。将蛋白质样品用胰蛋白酶酶解,分别被几种分子量相等的iTRAQ标签中的一种标记,然后混合。混合后将被标记的多肽通过强阳离子交换色谱（SCX）和纳升反相色谱（RP）分离,结合质谱（MS）分析。结果表明,在保证95%的置信度下,共有54个唯一肽段和6个标准蛋白质被成功鉴定,包括大肠杆菌的茁-半乳糖苷酶、茁-乳球蛋白、小鸡溶菌酶,人血清铁传递蛋白的蛋白质定量表达水平在样品A和样品B中未表现出显著差异,但样品B中牛血清白蛋白（BSA）和琢-乳白蛋白的数量均为样品A的一半。该结果与预期试验结果相符,且重复性好,表明此方法具有稳定性和可重复性,适用于蛋白质鉴定和表达水平的比较定量研究,此外,其能显著提高蛋白质混合物的研究通量。 相似文献
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【目的】深入了解家蚕幼虫期与蛹期马氏管蛋白质组的变化,为马氏管在不同发育时期的功能研究提供蛋白质水平上的依据。【方法】利用蛋白质双向电泳技术对家蚕5龄第5天及化蛹第1天的马氏管组织进行比较,并采用基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对表达量差异较大的蛋白点进行肽指纹图谱鉴定,应用GPMAW 8.00软件对NCBI蛋白质数据库中所有来自于P50/Dazao的蛋白质与家蚕9倍基因组预测蛋白质库共同构建本地数据库,对试验采集到的肽指纹图谱进行分析。【结果】共检测到360-430个蛋白点,主要分布在分子质量15-80 kD、等电点4.0-9.5。2个时期共成功鉴定17个表达量有显著差异的蛋白质,其中包括与能量代谢相关蛋白质、热激蛋白、V型H+ ATP合酶、30K蛋白以及与肾脏功能密切相关的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶 2,3-羟基异丁酸脱氢酶等。【结论】本研究中差异蛋白质的发现和鉴定为完全变态昆虫幼虫期与蛹期马氏管的功能差异提供了蛋白质水平上的理论依据。 相似文献
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【目的】检验Steedman’swax包埋切片DAPI染色法是否适用于观察花生根尖细胞核形态。【方法】分别采取100μmol/L AlCl3处理不同时间（0、4、8、12 h）后两个花生品种（铝敏感型中花2号和耐铝型99-1507）的根尖,经过Steedman’s wax包埋切片等一系列过程,利用荧光染料DAPI染色观察细胞核形态变化。【结果】100μmol/L AlCl3可引起花生根尖细胞核形态发生改变,核质浓缩、核边缘化、呈新月状等,具有明显的PCD特征。花生根尖细胞在铝胁迫下发生PCD,PCD程度与花生耐铝性呈负相关,与处理时间呈正相关。【结论】Steedman’swax包埋切片DAPI染色法是一种快速、高效的适用于观察花生根尖细胞核形态的方法。 相似文献
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【目的】通过对水稻骨干亲本在不同发育时期的蛋白质表达特征研究,了解其形成机理并促进其应用。【方法】采用Western blotting调查了6个水稻骨干亲本（9311、培矮64s、特青、珍汕97B、广陆矮4号和矮脚南特）在不同生长发育时期/部位（苗期地上部与地下部、开花期剑叶和穗子、成熟期剑叶和穗子）与光合作用、活性氧清除及胁迫防御相关的9个蛋白质的表达。【结果】9个蛋白质的表达在不同骨干亲本间有多态性,尤其在地下部和穗子等部位的表达差异较大,而在叶片中的表达比较接近;此外,蛋白质表达在不同生长发育时期/部位间也有多态性,反映了蛋白质表达的时空特异性。【结论】初步建立一条利用蛋白质特异抗体了解水稻蛋白质表达的研究途径。 相似文献
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【目的】探讨空心莲子草水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂的影响,为研究空心莲子草的化感作用机制提供参考。【方法】用蒸馏水（CK）、0.025、0.050、0.075和0.1000 mg/mL空心莲子草地下部分及地上部分的水浸提液分别对蚕豆根尖进行处理,观察不同处理蚕豆根尖细胞有丝分裂的变化。【结果】与对照相比,随着空心莲子草水浸提液剂量的增加和作用时间的延长,其对蚕豆根尖细胞有丝分裂的抑制作用不断加强;空心莲子草地上部分水浸提液的抑制作用较地下部分更强。在胁迫72 h后,0.100 mg/mL空心莲子草地上部分水浸提液对蚕豆根尖细胞有丝分裂的抑制作用最强,有丝分裂指数仅1.14%。经空心莲子草水浸提液处理后,蚕豆根尖细胞细胞核出现异常,部分细胞出现微核,在0-48 h内,随着处理时间的延长,细胞微核率呈上升趋势;此外,蚕豆根尖细胞出现多种染色体畸变,如微核、染色体断片、滞后染色体、染色体桥等。【结论】空心莲子草水溶性化感物质对受体植物的遗传物质具有一定的遗传损伤效应。 相似文献
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IAA对水稻根毛形成与水通道蛋白基因表达关系的研究 总被引：3，自引：0，他引：3
【目的】探讨气培条件下,IAA极性运输对水稻根毛形成及水通道蛋白基因表达的影响。【方法】以超表达OsPIN1a的转基因水稻和野生型水稻为研究材料,当种子根长为0.5-1.0 cm时,分别用不同浓度IAA、IAA和生长素极性运输输出载体抑制剂、IAA和生长素输入载体抑制剂复合处理的琼脂块贴在根尖一侧,黑暗条件下培养12 h后观察根毛生长情况,测定根毛的密度、长度及根毛形成后根尖部分相对含水量,并用激光共聚焦显微镜观察根尖及根毛内的OsPIN1a-GFP亚细胞定位,再通过半定量RT-PCR检测根毛形成前后水通道蛋白基因表达。【结果】（1）在0-5.0 mg·L-1 IAA浓度范围内,随IAA浓度增加,根毛长度和密度也增加,当浓度超过5.0 mg·L-1时,根毛长度和密度不再增加,根的生长受到显著抑制,2.5 mg·L-1 IAA诱导效果最好;（2）只有根尖分生区IAA处理后,才能诱导新的根毛区形成根毛,而其他区域处理后无法诱导根毛形成;（3）根毛形成不受低浓度的生长素极性运输输出载体抑制剂TIBA、NPA和IAA复合处理的影响,高浓度TIBA、NPA和IAA复合处理则显著抑制根毛形成及根的生长;（4）低浓度生长素极性运输输入载体抑制剂CHPAA和IAA复合处理能显著抑制根毛形成和根的生长;（5）IAA不但能诱导根毛形成,也能诱导多种水通道蛋白基因表达,提高根尖相对含水量;（6）根尖及根毛内的OsPIN1a基因的表达和OsPIN1a-GFP含量均受IAA诱导,并在根毛细胞内大量表达。【结论】在气培条件下,根毛形成需要IAA诱导,而IAA诱导根毛形成过程需要生长素极性运输输入和输出载体蛋白的参与,其中输入过程对根毛的形成影响最大。IAA极性运输输入或输出载体蛋白特异性抑制剂处理显著降低根毛形成和根的生长,因此OsPIN1a在根毛形成中起着重要作用,同时根毛水通道蛋白基因表达量增加,提高了根尖相对含水量,减缓了气培条件下水稻根尖的水分胁迫。 相似文献
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【目的】利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法获得转芪合酶基因烟草,改良烟草对根黑腐病的抗性。【方法】以普通烟草品种“97204”叶片为受体,采用根癌农杆菌介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组并进行分子检测,利用灌根法对4株转芪合酶基因烟草植株接种烟草根黑腐病菌,观察烟草地上部分和根部的变化,并测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性。【结果】通过根癌农杆菌介导、抗性选择和分子检测,获得32株转芪合酶基因烟草。从中选取长势一致的4株转基因烟草用于抗病性鉴定,结果表明,2株在灌根接种后生长正常,另外2株在接种第7天时出现轻微黄化,3株根部无发病症状,另外1株在接种16 d后根部出现发黑症状,而对照植株接种后第3天叶片就出现黄化及萎蔫症状,随着接种时间的延长,叶片黄化加剧,到第7天时已出现明显的发病症状,15 d植株几乎死亡;转基因烟草PAL及PPO活性本底均显著高于对照,PAL活性在接种后4～10 d保持在一个较高的水平,10 d后又迅速下降,PPO活性在接种2 d后迅速升高,在接种6 d达到峰值,之后开始缓慢下降,而非转基因烟草PAL、PPO活性与转基因烟草相似,但变化幅度较小。【结论】用于抗性鉴定的4株转芪合酶基因烟草中,有3株对烟草根黑腐病的抗性较好。 相似文献
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基于SSR标记的甜瓜品种（系）DNA指纹图谱库的构建 总被引：7，自引：1，他引：6
【目的】建立甜瓜品种的DNA指纹图谱数据库,实现对甜瓜品种进行快速、准确的鉴定。【方法】应用SSR分子标记技术,首先利用20份具有代表性的甜瓜品种（系）筛选SSR引物,然后对105份不同甜瓜品种（系）进行指纹图谱的构建。【结果】从1 219对SSR引物中筛选出18对引物为105份材料形成了多态性的指纹图谱,其中每对引物可以检测到4-14条数目不等的多态性条带,平均为9条;多态性信息含量（PIC）平均为0.68,变化范围为0.55-0.82。105份材料间的相似系数为0.70-0.99。利用这18对SSR核心引物构建的指纹图谱库能够有效区分所有供试材料,并且为每份材料建立了一份独特的指纹图谱。【结论】SSR标记适于构建甜瓜品种 （系）的DNA指纹图谱库,可为甜瓜品种鉴定提供依据。 相似文献
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【目的】克隆人参皂苷生物合成途径中的鲨烯环氧酶（SQE）基因,并进行原核表达与纯化,初步探讨SQE活性与人参皂苷生成量之间的关系。【方法】以4年生人参根组织须根为材料,提取其总RNA,反转录为cDNA。以合成的cDNA为模板,对SQE基因进行克隆,再将其插入原核表达载体pET-30a中,构建pET-30a-SQE重组质粒,经酶切和测序鉴定后,转入Rosetta大肠杆菌,经0.8 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达4 h后,进行SDS-PAGE电泳检测,采用NiAgarose亲和层析柱纯化目的蛋白,利用液相色谱串联质谱联用技术（LC-MS）检测SQE的活性。【结果】获得了人参SQE基因1 611 bp的全长编码区cDNA。酶切和测序结果表明,原核表达载体pET-30a-SQE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在Rosetta大肠杆菌中成功诱导表达了SQE融合蛋白,且纯化后的目的蛋白纯度较高;LC-MS联用检测结果发现,随着SQE用量的增加,达玛烯二醇的生成量递增。【结论】克隆了人参SQE基因,获得了在体外具有生物学活性的SQE蛋白,并证实了其活性与人参皂苷生成量有很大的相关性。 相似文献