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[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。 相似文献
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副溶血性弧菌的检测研究 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]对toxR进行副溶血性弧菌特异性检测,探讨toxR靶基因能否准确检测副溶血性弧菌,从而消除其他研究者对该基因特异性的疑虑。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探针对副溶血性弧菌和其亲缘关系接近的弧菌标准菌株进行检测。[结果]采用实时荧光PCR方法证实该引物探针只能扩增出副溶血性弧菌,其他弧菌诸如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等未得到扩增。[结论]证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高。该研究可为各检测机构提供数据支持,为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。 相似文献
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多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌 总被引：4，自引：0，他引：4
【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。 相似文献
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建立了环介导等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。以副溶血性弧菌tlh基因作为靶基因,设计特异性引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)检测方法,并分别采用LAMP检测方法和国家标准方法(GB/T4789.7-2008)对克氏螯虾样品中的副溶血性弧菌进行检测。结果表明,建立的LAMP方法最低检出限为1×101 cfu/mL;对6种细菌共8株菌进行LAMP法扩增,仅3株副溶血性弧菌得到阳性扩增。建立的LAMP检测方法与国家标准检测方法检测结果一致,准确度高。 相似文献
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[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特氏菌和空肠弯曲杆菌检测的基因芯片方法,并在实际应用中检测芯片的效果。[方法]以5种目标菌保守基因片段为模板设计引物,用待检样品增菌后提取的DNA模板进行2个独立的多重PCR扩增。扩增产物与固定有5种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交,用芯片扫描仪对芯片杂交结果进行扫描并判定结果。[结果]使用基因芯片检测5种细菌的检测下限分别为：金黄色葡萄球菌8.7×105cell/ml;大肠杆菌O157：H7 5.0×105cell/ml;沙门氏菌4.4×105cell/ml;单增李斯特氏菌2.4×105cell/ml;空肠弯曲杆菌6.2×106cell/ml。[结论]与传统方法比较,芯片法具有较高的特异性和灵敏性,是一种能应用于实际的快速高通量检测细菌的方法。 相似文献
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鲢鱼嗜水气单胞菌PCR检测方法的建立 总被引：4，自引：1，他引：3
根据基因库中嗜水气单胞菌16SrRNA基因序列,设计并合成一对特异性引物,用PCR方法对从病死鲢鱼体内分离到的1株嗜水气单胞菌进行扩增,并对PCR反应条件进行优化,同时测试了该方法的特异性和敏感性.特异性试验结果显示,该引物能扩增出680bp的嗜水气单胞菌特异基因片段,与鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、[HT5",7"]鱼[KG-*3]回[HT5"]爱德华氏菌及海豚链球菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低检测量为10pg嗜水气单胞菌基因总DNA.表明该实验所建立的PCR检测方法可用于鲢鱼嗜水气单胞菌的快速诊断,对有效治疗和控制鱼类嗜水气单胞菌病的流行具有重要意义. 相似文献
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[目的]建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持.[方法]以弧菌dnaJ基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性.[结果]优化后的PCR反应体系50.0 μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各2.0 μL,DNA模板5.0 μL,灭菌水补足至50.0 μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min.该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/mL.应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%~99.9%.[结论]基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段. 相似文献
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[目的]为进一步确定致病性副溶弧菌共有的特异性抗原和保护性抗原奠定基础。[方法]通过小鼠毒力试验研究5株副溶血性弧菌菌株对小鼠的致病性,比较在不同培养基和培养时间下所提取的外膜蛋白的SDS-PAGE图谱并通过Western blotting分析研究副溶血性弧菌菌株的免疫原性。[结果]5株临床分离的副溶血性弧菌菌株明显对小鼠具有不同的致病性,同时能在兔血平板上形成明显的溶血圈,为TDH阳性菌株。通过菌体免疫获得的多克隆抗体,与除副溶血性弧菌外的其他试验菌株均无交叉反应。Western blotting分析显示该多克隆抗体与5株致病性副溶血弧菌菌株可发生程度不等的阳性反应,提取的外膜蛋白具有较好的免疫原性。[结论]该研究为制备有效预防副溶血性弧菌引起的疾病的菌苗提供了理论基础。 相似文献
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一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法（摘要）（英文） 总被引：6，自引：0，他引：6
[目的]介绍一种适于拟南芥PCR检测的DNA快速提取方法。[方法]通过对常规DNA提取方法的改进（省去液氮研磨和苯酚提取的步骤）,获得可以快速大批量地提取拟南芥DNA样品的方法。于1.5ml Eppendorf管内加入400μl DNA提取液[内含200 mmol/LTri（pH值7.5）,25 mmol/LEDTA（pH值8.0）,250 mmol/LNaCl,0.5% SDS（W/V）],剪取拟南芥叶片材料少许（1片以下）加入400μl DNA提取液,用微型研磨棒将叶片捣碎至溶液成绿色,放置3 ～5 min;加入400μl氯仿/异戊醇（体积比24：1）,混合均匀,12 000 r/min离心5 min;取上清液至另一1.5 ml Eppendorf管内,加入300μl异丙醇,颠倒混合均匀,室温下放置5 min,12 000 r/min离心5 min;弃去上清液,以70%乙醇漂洗,放置晾干,加入100μl灭菌超纯水溶解,4℃放置备用。以随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系为样品进行验证。[结果]经过琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收检测,DNA样品完整且污染少,PCR扩增目的片段结果良好,适于作为PCR反应的模板。经过对随机抽取的拟南芥转基因株系和突变株系的PCR检测,阳性植株目的基因扩增条带清晰,无假阳性,试验结果理想。[结论]该方法适用于拟南芥DNA样品的快速提取、PCR检测及拟南芥突变体筛选工作。 相似文献
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[目的]制备出一套针对港口航道致病性细菌检测的基因芯片,为港口航道基因芯片检测技术的研究及应用打下基础.[方法]采用常规方法提取目标菌株基因组DNA,以16S rDNA通用引物和gyrB基因保守区引物进行PCR扩增,使用AlleleID 6.0和Array Designer 4.25对扩增获得的目的片段进行寡核苷酸探针设计,经PCR筛选验证,目标探针以氨基化修饰后通过芯片点样仪点制在醛基玻片上;优化芯片杂交固定条件,并用于港口航道的水样检测,以验证微阵列基因芯片的检测效果.[结果]优化后的芯片杂交固定条件为探针点样浓度10μmol/L、紫外交联时间2.0 h、杂交温度65℃,有效提高了基因芯片检测的灵敏度,与传统检测方法相比可实现快速、高通量、准确的目标.研制的微阵列基因芯片可特异性检测出港口航道中含有的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Emterobacter cloacae)、溶藻弧菌(V.alginolytivus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和创伤弧菌(V.vulnificus)等7株致病性细菌,且均未出现非特异性杂交.[结论]针对港口航道致病性细菌建立的微阵列基因芯片检测技术具有特异性强、灵敏度高、快速便捷的特点,可用于港口航道及周边地区的海洋环境监测和海产品质量安全检测. 相似文献
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[目的]探讨了高简并性引物扩增庞大基因家族基因的特殊方法。[方法]采用常规高简并引物对鲤鱼基因组DNA分析进行了常规PCR扩增、常规降落PCR扩增以及优化后的小温度范围不规则跳跃降落PCR扩增。[结果]采用PCR仅得1条明显条带,得到的基因较少;采用常规降落PCR法仅得到弥散性扩增,无明显条带出现;而采用小温度范围的不规则跳跃降落PCR则得到了得到了3条明显条带和多个基因,扩增结果理想。[结论]为庞大基因家族扩增条件中的优化与选择提供了理论依据。 相似文献
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荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌 总被引：5，自引：1，他引：4
[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。 相似文献
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[目的]筛选经济、稳定性好的水稻PCR反应体系,并检测所选体系在不同的基于PCR反应的分子标记中的通用性。[方法]以CTAB法提取的水稻叶片DNA为模板,应用L16（45）正交设计进行PCR反应体系优化。[结果]16个不同处理组合均扩增出了清晰谱带,但扩增效果及PCR产量有差异。最经济、适用的体系：20μl反应体系,20ng模板DNA,浓度150μmol/LdNTP,浓度0.2μmol/L引物,1.0UTaqDNA聚合酶,浓度1.5mmol/LMg^2＋,1×Taqbuffer,剩余体积用超纯水补齐。[结论]试验确定了水稻PCR优化反应体系,该体系也适用于一些其他基于PCR反应的标记。 相似文献