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2种方法银染的AFLP片段再扩增效果比较及改进 总被引：6，自引：0，他引：6
Bassam银染法和Sanguinetti银染法是AFLP标记最常用的检测方法.本研究比较这2种方法银染的AFLP条带再扩增效果的差异,发现Bassam法银染的AFLP片段再扩增效率达到100%,而用同样的PCR条件,sanguinetti法银染的AFLP片段不能被扩增,限制了Sanguinetti法在AFLP标记分析中的应用.为提高Sanguinetti法银染的AFLP片段再扩增效率,对Sanguinetti法银染的AFLP片段回收和再扩增条件进行了改进.通过增加Sanguinetti法显色后的胶板漂洗次数、延长漂洗时间、改变AFLP条带浸泡溶液、增加浸泡液体积和增加PCR循环次数,成功地将Sanguinetti法银染的AFLP条带的再扩增效率提高到100%,从而解决了San-guinetti银染法应用的限制因素. 相似文献
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PAGE凝胶制备方法和银染方法的改进 总被引：4，自引：0，他引：4
PAGE凝胶分析技术已广泛运用于小分子量PCR产物的分离,但因操作环节多、耗时长,不利于大规模分子标记分析工作的开展.对PAGE凝胶的制备和银染方法作些改进,省去常规凝胶制备中亲和硅烷/剥离硅烷处理过程,以及常规银染过程中的固定和定影两步骤.与常规方法相比,该方法操作简便、耗时短、带谱的分辨率高,可代替常规方法用于SSR等标记的PCR产物的分离. 相似文献
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薏苡AFLP体系的建立与优化 总被引：1，自引：0，他引：1
以30个不同薏苡种质为试验材料,利用AFLP分子标记技术进行遗传多样性及亲缘关系的研究。通过对AFLP常规流程中（基因组提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、电泳及银染检测）关键因素进行优化,建立适合薏苡的AFLP扩增检测体系。结果表明,采用酶切与连接分开的两步法,酶切完全,每步反应时间4 h并附加15 min的酶失活时间;连接产物稀释10倍;预扩增产物稀释50倍,试验效果最佳。应用优化后体系,从64对引物中筛选出14对多态性较好的薏苡AFLP选择性扩增引物。 相似文献
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牡丹基因组AFLP银染反应体系的建立和优化 总被引：8，自引：1，他引：8
采用改进的SDS方法,从牡丹成熟叶片中提取基因组DNA,所得DNA样品的A260/A280值在1.7～1.8之间,琼脂糖凝胶电泳主带清晰、DNA纯度高、较少降解、不含酶反应抑制剂,可被MseⅠ和PstⅠ两种限制性内切酶完全酶切.通过酶切连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验过程,成功建立了牡丹品种AFLP银染反应体系,得到了清晰的指纹图谱.对扩增结果进行聚类分析,得到了23个牡丹品种的聚类分析图. 相似文献
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枸杞属AFLP分析体系优化与建立 总被引：1，自引：0，他引：1
以枸杞属种质资源为试材,对AFLP分析过程中包括DNA的提取质量和浓度、Mse I/EcoR I以及T4 DNA连接酶的浓度、反应时间等影响因素进行了研究.建立了一种适于枸杞AFLP银染技术的优化体系.该体系中各优化因素为:模板DNA的用量为300～400 ng,酶切体系中Mse I和EcoR I各加入3 U,T4 DNA连接酶加入2.0U,采用酶切与连接在同一体系中一步完成,其酶切温度为37℃,反应时间为5 h.与22℃连接过夜.并对预扩增、选择性扩增和银染的效果进行了检测,以引物M+CAC/E+AGG构建了枸杞种质资源的AFLP指纹图谱,该图谱扩增带多,多态性强,且质量好. 相似文献
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建立适宜金龙胆草DNA 的SRAP-PCR 扩增体系为金龙胆草分子标记打下基础,针对常规银染方法从
是否固定银染液组成银染时间显影液组成等方面优化了金龙胆草SRAP 扩增产物的检测方法同时探索了金龙
胆草SRAP-PCR 反应程序,并对金龙胆草SRAP-PCR 反应体系的各影响因子进行优化结果建立了一个银染步骤
快速高效的银染检查方法筛选的退火温度为51.3,最佳SRAP-PCR 反应体系(15 L) 为院DNA 40 ng,引物浓度
0.7 mol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Mg2+1.9 mmol/L,Taq 聚合酶0.6 U,10buffer 2 L,双蒸水补足该程序和体系能很好
地满足金龙胆草基因组SRAP 扩增的要求SRAP 标记应用于金龙胆草遗传研究是可行的。 相似文献
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【研究目的】为了建立甘蔗AFLP标记技术体系;【方法】本文通过对甘蔗抗、感黑穗病的杂交亲本CP84-1198和科5,以及根据其杂交后代的浸渍接种田间抗性鉴定结果所构建的抗、感黑穗病池的AFLP银染法分析;【结果】建立了甘蔗黑穗病抗性的AFLP分析实验体系,同时将AFLP-银染技术应用于甘蔗近缘植物斑茅抗旱胁迫及其对照材料的cDNA差别筛选,建立了一种mRNA差别显示技术体系。实验过程中还筛选出了四对能在抗、感亲本上扩增出特异条带的引物,以及一对在斑茅水分胁迫和对照中表现良好差异的引物,为下一步的实验工作的开展奠定了基础。【结论】通过本实验建立了甘蔗AFLP分析技术体系、变性聚丙烯酰胺凝胶的快速银染、凝胶简单保存以及聚丙烯酰胺凝胶中的特异条带的高效回收技术。 相似文献
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[目的]优化龙眼AFLP银染体系中的影响因素。[方法]以23份龙眼品种和2份龙眼近缘植物龙荔为试材,通过对扩增片段长度多态性(AFLP)反应体系中的几个影响因素(DNA提取、酶切与连接、电泳与银染)进行研究,建立起龙眼AFLP银染分析体系。[结果]用紫外分光光度计检测样品DNA质量和浓度,发现提取的DNA吸光度A260/A280比值在1.8左右,A260/A230的比值大于2.0,说明所提取的DNA样品纯度较高,无蛋白质或盐类的污染。酶切与连接中采用37℃水浴5 h,然后转入65℃水浴2 h的方法能保证酶切充分,又能防止酶切过度。电泳和银染时用4℃预冷的显影液进行显影,可以降低显影速度。[结论]采用该技术体系得到的AFLP指纹式样清晰,重复性强,适宜用作龙眼品种鉴别和遗传多样性分析。 相似文献
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黄瓜基因组DNA提取及AFLP体系优化研究 总被引：2，自引：1，他引：1
［目的］提取黄瓜基因组DNA,并对AFLP体系进行优化。［方法］以黄瓜嫩叶为材料,利用改进的CTAB法提取高质量的黄瓜叶片总DNA,通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件建立适合黄瓜的AFLP银染体系,得到清晰的黄瓜AFLP指纹图谱。［结果］DNA 模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应,改良的CTAB 提取法可用于黄瓜AFLP 分析,形成清晰的AFLP 指纹。优化的酶切连接体系为：以37 ℃酶切连接12 h为宜,酶切连接的基因组DNA用量为200 ng,预扩增时Taq酶用量为0.5 U/20 μl体系,预扩增产物稀释40倍作为选择性扩增的模板。在此优化的体系下引物E41M47扩增出清晰的条带。［结论］为黄瓜品种的分子标记和黄瓜品种间亲缘关系等研究奠定了基础。 相似文献
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AFLP在濒危植物岷江柏中的应用初探 总被引：4，自引：0，他引：4
以14个岷江柏野生居群个体为试材,对AFLP分析过程中的影响因子（酶切与连接、预扩增、选择性扩增和银染）进行了研究.筛选出4对扩增稳定且多态性丰富的AFLP引物;得到扩增条带274条,多态性带137条（占50.00%）. 相似文献
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4种扇贝AFLP分析体系的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
构建了4种扇贝扩增片段长度多态性(AFLP)的分析体系,对DNA提取、双酶切反应、连接反应、预扩增反应、选择性扩增反应和银染等条件进行了优化。结果表明:用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切,核心序列加3个选择性碱基的选择性扩增引物,E32-M49和E32-M62两个引物组合,以及20μL选择性扩增体积,可得到十分稳定的结果。所得产物经电泳和银染后可获得条带清晰、背景干扰小的图像。该体系的构建为AFLP技术在扇贝相关研究中的应用提供了依据。 相似文献
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以采自广西、云南和河南等地的紫薇属Lagerstroemia植物紫薇L.indica,南紫薇L.subcostata,福建紫薇L.limii和桂林紫薇L.guilinensis叶片为材料,利用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取叶片基因组DNA,获得了高质量的紫薇叶片DNA,并以其基因组DNA为模板进行了酶切连接,利用酶切连接的产物稀释一定倍数作为预扩增的模板,最后以稀释一定倍数的预扩增产物进行选择性扩增,进行紫薇和南紫薇的AFLP（扩增片段长度多态性）银染反应体系的优化。AFLP体系中每一步反应都设置了不同的反应体系,采用了160对引物作为初选引物,筛选出了10对适合紫薇基因组扩增的引物。结果表明,适宜紫薇基因组扩增的最佳酶切、预扩增和选择性扩增体系为：酶切连接体系1;预扩体系3;选扩体系3,反应体系中Mg2＋质量浓度为1.2×10-6kg.L-1时扩增效果较好。 相似文献
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山核桃AFLP实验技术体系的建立 总被引：5，自引：1，他引：4
以充分展开的山核桃Carya cathayensis嫩叶为材料、利用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法与CTAB裂解一硅珠吸附法提取山核桃总DNA,对适合于山核桃叶片的AFLP（扩增片段长度多态性）分析体系进行了摸索。结果表明：①改良CTAB法适用于从山核桃叶中提取高质量的DNA,提取的DNA可用于AFLP的分析;②采用EcoR I/Mse I 酶切组合,酶切连接一步法与两步法的效果没有明显的差异,但一步法操作更为简便;③适合于山核桃叶AFLP分析的引物组合为E-ACT＋M-CAT,E-ACT＋M-CTG,E-ACG＋M-CAT,E-ACG＋M-CTG。扩增产物经60g·L^-1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染,条带信号强度一致性好,条带分布均匀、清晰,分辨率较高。 相似文献