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1.
为了探讨硫藤黄链霉菌中可能存在的次级代谢产物合成及调控机制,以链霉菌整合型质粒pJTU2554为载体,构建了硫藤黄链霉菌的基因组表达文库。以模式菌株变铅青链霉菌为异源表达宿主,通过生物活性筛选获得9株具有抑菌活性的异源表达突变菌株,同时通过PCR筛选获得多个含有聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的克隆子。TLC及HPLC-MS分析发现6个携带有aureothin生物合成基因簇的cosmid,通过异源表达在变铅青链霉菌中成功合成聚酮类抗生素aureothin,证实文库异源表达及筛选的有效性。 相似文献
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通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定,结合DNA序列测定,从刺孢吸水链霉菌AA97026中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇,获得1个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆1H5,其部分DNA序列与链丝菌素生物合成基因相似。含1H5的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份,表明1H5含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。 相似文献
3.
以变铅青链霉菌TK24为出发菌株,依次敲除钙依赖抗生素(CDA)、放线紫红素(ACT)和十一烷基灵菌红素(RED)这3个内源抗生素的生物合成基因簇,同时在钙依赖抗生素基因簇原位整合了来自棒状链霉菌的全局性调控基因afsRScla,构建得到变铅青链霉菌菌株SBT5。将来自天蓝色链霉菌的放线紫红素生物合成基因簇导入SBT5中,接合子产生大量蓝色的放线紫红素,而出发菌株TK24只产微量蓝色抗生素;SBT5接合子的ACT产量也显著高于导入了额外act基因簇拷贝的出发菌株接合子。SBT5菌株次级代谢背景清晰,不产色素类抗生素和抗细菌抗生素,可作为高效宿主用于次级代谢产物基因簇的异源表达和筛选。 相似文献
4.
《湖北农业科学》2015,(15)
为了发展一种将150 kb及以上的外源DNA片段引入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的有效方法,以大肠杆菌-变铅青链霉菌穿梭细菌人工染色体为载体,将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个150~180 kb的外源DNA片段期望以接合转移的方式从大肠杆菌宿主菌(Escherichia coli ET12567/p UZ8002)中横向转移入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK23菌株中。结果表明,接合转移技术能够有效地将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个外源DNA大片段引入到变铅青链霉菌基因组中并稳定传代。 相似文献
5.
针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段. 相似文献
6.
杨凌链霉菌（Streptomyces yanglingensis）KM-1-2是从银杏种子中分离到的一株新菌，为对其次级代谢产物基因簇进行研究，需建立该菌株的遗传转化体系。通过接合转移的方法成功建立杨凌链霉菌KM-1-2的遗传转化体系，并确定最佳接合转移条件：以2CMY为接合转移培养基，孢子于50 ℃热激10 min，抗生素覆盖时间介于18~19 h，其中萘啶酮酸质量浓度为25 mg/L，安普霉素为3 mg/L，接合转移效率达 1.052×10-5。同时，利用该转化体系，过表达KM-1-2基因组中的1个SARP转录调控因子km790。与野生型链霉菌KM-1-2相比，过表达菌株Skm790生长速率加快，产孢时间提前，对部分病原真菌的拮抗性增强，而且代谢产物图谱发生明显变化。 相似文献
7.
由卵菌病原物致病疫霉菌引起的马铃薯晚疫病是造成马铃薯毁灭性损失的病害。为了筛选致病疫霉菌RXLR效应蛋白AVR1-like(AL)的寄主靶标,以致病疫霉菌88069菌株的DNA为模板,克隆致病疫霉菌效应蛋白AL,并将其成功构建到pGBKT7载体上,形成诱饵载体。将pGADT7和重组诱饵载体共转化到酵母感受态AH109中,检测到诱饵载体无自激活作用。利用酵母双杂交技术以AL为诱饵筛选晚疫病菌侵染12 h后的番茄cDNA文库,初步获得6个候选AL寄主靶标。对6个候选靶标与AL进行一对一互作验证,结果表明其中有5个与诱饵载体强互作,1个弱互作。这些候选寄主靶标包括热休克蛋白同源蛋白、单脱氢抗坏血酸还原酶蛋白、过氧化物酶体蛋白等。 相似文献
8.
[目的]本文旨在筛选土壤微生物来源的芳香聚酮抗生素。[方法]通过宏基因组学技术,利用基于酮基合成酶基因(KSα)保守序列设计的简并引物筛选土壤宏基因组文库,获得含有芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。对阳性克隆质粒测序并通过BLASTx同源比对分析其所包含的芳香聚酮生物合成基因簇。通过接合转移方法将基因簇整合进异源表达宿主白色链霉菌基因组中,培养发酵接合子,利用高效液相色谱技术确定克隆特异性产物并对发酵产物进行抑菌活性检测。[结果]从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库第493号混合文库中扩增得到了1个KSα片段ZF493,蛋白序列分析显示其与酮基合成酶同源,文库筛选得到了含有其对应芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆cos493。对cos493的测序分析显示其插入片段大小为34 kb,包括酮基合成酶基因(KSα,orf 21)、链长因子基因(KSβ,orf 20)、酰基载体蛋白基因(ACP,orf 19)、环化酶基因(CYC,orf 17和orf 18)、糖基转移酶基因(orf 12)、单加氧酶基因(orf 16)等芳香聚酮合成相关基因。ORF 21与化合物calixanthomycin A聚酮合酶的KSα有67%的相似性,ORF 20与化合物griseorhodin A的KSβ有49%的相似性。通过接合转移使含芳香聚酮合酶基因簇的cos493整合进白色链霉菌宿主基因组中。高效液相色谱分析发酵粗提物发现了2个克隆特异化合物峰,紫外光谱分析显示化合物1在223、296和420 nm处有特征吸收峰,化合物2在214、261和447 nm处有特征吸收峰,特异峰具备芳香聚酮化合物的紫外吸收特征。对发酵粗提物的抑菌活性检测发现,其对金黄色葡萄球菌有抑制作用。[结论]本研究运用基于序列的宏基因组学技术,在链霉菌宿主中表达了来源于土壤微生物的芳香聚酮合酶基因簇并产生了具有抗菌活性的化合物。 相似文献
9.
克隆组装了大肠杆菌的乙酰-CoA羧化酶基因acc,以研究其异源表达对变铅青链霉菌中2种“沉默”抗生素放线紫红素和十一烷基灵菌红素合成的影响。大肠杆菌ACC由4个基因编码,通过PCR扩增4个基因,并通过重叠延伸PCR加上ermE启动子,构建得到4个重组基因;再将重组基因依次组装得到异源表达质粒pHLZ11,接合转移到变铅青链霉菌中进行异源表达。结果显示：含有异源表达质粒的变铅青链霉菌接合转移子能合成放线紫红素而十一烷基灵菌红素产量提高。表明大肠杆菌acc基因异源表达能够激活变铅青链霉菌沉默抗生素的合成,并提高已有抗生素产量。 相似文献
10.
利迪链霉菌A01可以产生大量的抗生素——纳他霉素,其通过结合病原真菌细胞膜上的甾醇分子而起到抑制病原菌生长的作用.燕麦噬酸菌的鞭毛蛋白组分FLAGELLIN可以诱导植物抗性,激发活性氧及水杨酸防御反应途径.本研究将燕麦噬酸菌蛋白激发子基因flagellin克隆,接合转移入利迪链霉菌A01中,使工程菌增加诱导植物抗性的功能.PCR验证表明:成功获得了含flagellin基因的阳性工程菌株,证明通过链霉工程菌构建可实现抗生与诱抗的协同作用,预计会提高防治植物病害的效果. 相似文献
11.
为筛选遗传背景清晰、裂解性能优良、宿主识别谱广泛的噬菌体用于抗菌产品开发,满足畜禽减抗、无抗养殖需求,通过易错PCR技术定向改变T7噬菌体尾丝蛋白羧基末端基因序列,并构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,为筛选识别不同宿主的T7噬菌体奠定基础。提取T7噬菌体基因组,用SfiⅠ进行单酶切,回收SfiⅠ位点左侧基因组。常规PCR扩增尾丝蛋白羧基末端基因序列(TF-ct,约350 bp)以及gene17至T7基因组右侧末端基因序列(约4 000 bp)。以回收的TF-ct片段为模板,进行易错PCR扩增,将随机突变的TF-ct基因片段连接T载体,构建质粒文库。从质粒文库中用SfiⅠ/SphⅠ双酶切出TF-ct片段,并与SfiⅠ位点左侧基因组片段、gp17右侧基因组片段进行连接,利用包装蛋白拯救出T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库。结果易错PCR成功扩增TF-ct基因片段,并连接T载体构建质粒文库;同时随机突变的基因正确插入T7噬菌体基因组相应位置,成功拯救出尾丝蛋白定向进化T7噬菌体文库。从噬菌体文库中随机挑选15个克隆进行序列分析,目的基因的突变率在1.23%~2.16%;尾丝蛋白loop区域的氨基酸突变改变了T7噬菌体吸附宿主的能力。本研究成功构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,验证了loop区域在T7噬菌体识别宿主过程的作用,为后续筛选有益噬菌体开发抗菌产品提供支撑。 相似文献
12.
根据吸水链霉菌“应城变种10—22”的一个文库质粒pHZ1392的测序结果设计了1对引物,聚合酶链反应扩增编码TetR的663bp基因,利用T载体和蓝白斑筛选构建了克隆质粒T-TetR,经序列测定确认扩增序列正确后克隆至pET24a,构建了表达质粒pET24a—TetR,再经序列测定确认未发生移码后转化表达宿主菌E.coli D1521(DE3),IPTG诱导后的SDS—PAGE分析显示蛋白表达获得成功,并进一步利用Ni—NTA树脂纯化了TetR蛋白。 相似文献
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小麦—簇毛麦6VS／6AL易位系叶片cDNA文库构建及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
用表达型质粒载体p^SPORT1构建了经白粉菌（Erysiphe graminis)诱导48h和未经诱导的小麦－簇毛麦6VS／6AL易位系（Triticum aestivum-Haynaldia villosa translocation lin)叶片cDNA库各一个，库宿主菌为E.coli DH10B，非诱导库包含约50万个重组cDNA克隆，平均插入征段为1．25kb，主要分布在400bp-2.2kb。诱导民含约30万个重组cDNA克隆，平均插入片段1．2kb。用克隆的病程相关基因（pathogenesis related gene)，＝－小麦类甜蛋白基因pWIR作探针，进行杂交筛库，杂交信号明显，重复性好。 相似文献
14.
【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头,再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNAT7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL,扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95．83％,且插入片段主要分布于500-2000bp,其中500～750bp的占21．73％,750～100bp的占21．73％,1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。 相似文献
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两株根肿病生防放线菌的鉴定及其防病效果 总被引：2，自引：1，他引：1
：【目的】鉴定从白菜根际土壤及红豆树根部分离得到的抑制根肿病菌休眠孢子萌发的生防菌株A316和A10,并探明其防病潜能,对根肿病进行有效的生物防治。【方法】根据菌株A316和A10的形态与培养特征、生理生化特性、16S rDNA序列对其进行鉴定;评价菌株A316和A10在室内盆栽及大田小区试验中对白菜根肿病的防治效果。【结果】菌株A316与链霉菌中的灰红链霉菌（Streptomyces griseoruber） NBRC 12873亲缘关系最近,同源性达99.9%,且形态与培养特征、生理生化特性与灰红链霉菌相符。菌株A10与GenBank数据库中多个相似性序列的亲缘关系都较近,鉴于其形态与培养特征、生理生化特性,只能归于链霉菌中的灰褐类群。菌株A316、A10对白菜根肿病的室内盆栽防效分别为72.8%、67.2%,而大田小区试验中防效依次达68.5%、56.7%,且可分别使白菜单位面积产量增加96.1%、64.9%。【结论】菌株A316鉴定为灰红链霉菌;菌株A10归于链霉菌中的灰褐类群（S. sp.）。菌株A316和A10对芸苔根肿菌显示出极好的生防潜能,A316的防效好于A10。 相似文献
16.
蜱的免疫预防是目前国内外研究的热点,以抗血清为探针筛选cDNA表达文库是获取功能抗原基因的有效的方法之一,为了获得抗长角血蜱免疫原基因,用兔抗长角血蜱血清和兔抗长角血蜱唾液腺蛋白血清对长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库进行了免疫筛选,经过两轮筛选共获得34个阳性克隆,所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之亚克隆为重组质粒,用此质粒转化宿主菌JM109并进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:在长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库中获得26个长角血蜱免疫相关cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱HL35、黏附素hlim3假定蛋白、热休克蛋白、NADH脱氢酶、钙网蛋白以及杂色花蜱和肩突硬蜱的二硫异构酶等具有同源性.所获阳性克隆为长角血蜱保护性抗原基因的筛选奠定了基础. 相似文献
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[目的]为乳酸菌的发酵生产奠定基础。[方法]从14株耐碱微生物中筛选出1株性能优良的产乳酸菌LP3-3,并通过单因素试验对该菌发酵生产乳酸的培养基进行优化。[结果]产乳酸菌LP3-3经16S rRNA序列测定初步鉴定为金橙黄微小杆菌（Exiguobacteriumaurantiacum）。经优化,产乳酸菌LP3-3培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母膏,酵母膏用量为1%,碳氮比为5。确定了其最佳发酵培养基组成：葡萄糖50.0 g/L,酵母膏10.0 g/L,蛋白胨4.0 g/L,乙酸钠（无水）2.0 g/L,柠檬酸三铵2.0 g/L,K2HPO4.H2O 2.0g/L,MgSO4.7H2O 0.2 g/L,MnCl2o4H2O 0.05 g/L,吐温80 1 ml/L,NaCl 40 g/L,初始pH为9.0。[结论]通过培养基的优化提高了产乳酸菌LP3-3的活力。 相似文献
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J Groffen N Heisterkamp F Grosveld W Van de Ven J R Stephenson 《Science (New York, N.Y.)》1982,216(4550):1136-1138
To define the human homolog (or homologs) of transforming sequences (v-fes gene) common to Gardner (GA) and Snyder Theilen (ST) isolates of feline sarcoma virus (FeSV), a representative library of human lung carcinoma DNA in a cosmid vector system was constructed. Three cosmid clones were isolated containing GA/ST FeSV v-fes homologous cellular sequences, within 32- to 42-kilobase cellular inserts representing 56 kilobases of contiguous human cellular DNA. Sequences both homologous to, and colinear with, GA or ST FeSV v-fes are distributed discontinuously over a region of up to 9.5 kilobases and contain a minimum of three regions of nonhomology representing probable introns. A thymidine kinase selection system was used to show that, upon transfection to RAT-2 cells, the human c-fes sequence lacked detectable transforming activity. 相似文献