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1.
为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明,它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时,为了获得侧翼序列,分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增,确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列,明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置,也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。 相似文献
2.
Inverse PCR法快速测定转基因马铃薯中T-DNA的拷贝数 总被引：1，自引：0，他引：1
利用Inverse PCR技术分析原生质体途径导入PLRV-CP基因的马铃薯转基因后代T-DNA拷贝数,结果与Southern Blot相同。经RT-PCR分析,低拷贝数的转基因后代显阳性反应,多拷贝数的显阴性反应,说明T-DNA多拷贝数影响外源基因的表达。Inverse PCR技术能为早期快速准确预测转基因植株中外源基因的T-DNA拷贝数,排除多拷贝重复串联序列诱导的外源基因沉默植株,为获得稳定表达的转基因株系提供有效方法。 相似文献
3.
为明确转cry2Ab4基因抗虫棉（L280）与转cry2Ab4、vip3Aa11基因双价抗虫棉（L282）在棉花基因组中的插入位点。通过融合引物与巢式聚合酶链式反应（Fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR）的方法获取T-DNA的侧翼序列。分析表明，它们分别位于棉花D13染色体61 309 969-61 309 997 bp区间和D11染色体11 069 019-11 069 039 bp区间。同时，为了获得侧翼序列，分别在棉花基因组和T-DNA上设计特异性引物进行PCR扩增，确认2种转基因抗虫棉中T-DNA在基因组上的位置。通过FPNI-PCR方法成功地分离到了转基因抗虫棉的侧翼序列，明确了T-DNA在2种抗虫棉基因组中的插入位置，也为转基因抗虫棉的后续研究及安全评价提供了重要的技术支持。 相似文献
4.
采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。 相似文献
5.
为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。 相似文献
6.
抗虫玉米MON89034转化体特异性PCR检测技术研究 总被引：5，自引：2，他引：3
根据抗虫玉米MON89034外源插入片段5’端与植物基因组连接区序列设计特异性引物,并进行PCR扩增,预期产物大小为455 bp。以zSSIIb基因作为内标准基因,建立了转基因玉米MON89034转化体特异性定性PCR检测方法。对该方法进行重现性、特异性和灵敏度测试,结果表明:该方法能够特异性检测出MON89034转化体,以100 ngDNA为模板,该方法的检测灵敏度达到0.1%,约为40个起始模板拷贝。复合PCR检测结果还表明,在同一PCR反应管中可实现对zSSIIb基因和MON89034的同时检测。 相似文献
7.
转基因油菜RF1的外源基因插入位点分析与事件特异性检测方法研究 总被引：5，自引：1，他引：4
采用基因组步移和巢式PCR方法研究了转基因油菜雄性不育恢复系RF1外源基因插入位点序列特征,并根据此特征建立了RF1转化事件特异性检测方法。从RF1基因组DNA中分离到外源基因插入位点的左边界旁侧序列798bp,包括335bp的插入载体序列和463bp的旁侧基因组序列。根据已发表的RF1右边界旁侧序列的信息,发现外源T-DNA在向油菜基因组整合的过程中,在整合位点处有75bp的基因组序列丢失。根据分离的RF1左边界旁侧序列,建立了RF1事件特异性定性检测方法,扩增片断大小为284bp。利用建立起来的RF1事件特异性定性检测方法可以准确的将转基因油菜RF1与其它的转基因油菜品种区分开,检测灵敏度达到5个拷贝（0.013%）。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因油菜品种RF1的身份识别提供了有效的方法。 相似文献
8.
HSSP基因植物表达载体构建及其对大豆的遗传转化 总被引：1，自引：0，他引：1
大豆中含硫氨基酸匮乏,限制了大豆的营养价值和商业价值。为了提高大豆的含硫氨基酸含量,利用人工设计合成的高含硫氨基酸贮藏蛋白基因(HSSP)转化大豆。以载体p TF101.1为骨架,构建植物表达载体p TFGS,利用农杆菌介导法转化大豆品种东农50,经PCR及试纸条检测,获得转基因大豆16株,基因的转化效率为1.94%。对转基因大豆株系GSDL5进行组织特异性分析,结果表明,HSSP基因在种子中超量表达,而在其它组织部位仅有微量表达。采用接头PCR方法对株系GSDL5基因组插入位点侧翼序列进行克隆,获得与大豆基因组序列匹配的436 bp侧翼序列,HSSP基因插入2号染色体基因的非编码区。经研究,获得了遗传背景明确的,仅在大豆种子中超量表达HSSP的转基因株系GSDL5。 相似文献
9.
确定外源基因在水稻基因组上的插入位置,是转基因水稻研究的重要内容之一。为了建立一种简单、快速、准确的获取外源基因在水稻基因组上插入位置侧翼序列的方法,结合前人TAIL PCR引物设计的原则和经验,以转入水稻基因组中的Bar基因为锚定基因,设计了既能作为锚定引物又能作为随机引物使用的一系列单引物,应用这些单引物通过单引物PCR成功获得了外源基因在水稻基因组插入位点的侧翼序列。这种方法与目前较为常用的TAIL PCR相比,简化了70%左右的试验步骤,节省了60%以上的试验时间,是一种简便、快捷的获得未知侧翼序列的方法。 相似文献
10.
应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034 总被引：1，自引：1，他引：0
根据MON89034玉米的5’端和3’端边界序列分别设计1组转化体特异性的巢式PCR引物,采用中途进退式PCR策略建立MON89034玉米的转化体特异性检测方法,扩增产物分别为491 bp和188 bp。以转基因玉米MON89034及8种其他转基因作物为材料,证明此方法对MON89034玉米具有高度特异性。灵敏度测试结果表明,此方法的相对检出限达到0.01%,绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数,比普通PCR提高了5倍。建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品。 相似文献
11.
将组成型表达的玉米泛素启动子与豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI连接,插入根癌农杆菌双T-DNA质粒,构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg;另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体,用以转化农杆菌菌株,再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选,用特异PCR扩增和Southern杂交检测,从分化再生的T0代植株中,鉴定出7个转化CpTI基因的阳性植株。目前,正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定,培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。 相似文献
12.
多重PCR快速检测甘蔗转基因成分研究 总被引：1，自引：0，他引：1
以单子叶植物常见外源转基因元件Ubiquitin启动子、NOS启动子、NOS终止子、Bar基因和Bt基因序列设计多重PCR引物,通过对PCR扩增体系中退火温度、Premix TaqTM浓度、引物浓度的优化,建立一种快速检测转基因甘蔗成分的多重PCR方法。结果表明:建立的体系一次能有效检测5个参数,其检测的最低DNA质量百分比可达1.0%,并在多个转基因甘蔗品种检测中得到验证。 相似文献
13.
利用经PCR、GUS染色和Southern杂交均证明已成功转入Hb CBF1的、田间表型为矮化的橡胶树植株C1为材料,通过TAIL-PCR的方法获得T-DNA右侧侧翼序列1.6 kb,根据侧翼序列与载体的序列设计引物分析验证该序列真实可靠,并设计引物判断基因的T-DNA插入以杂合位点存在,与此同时,将该侧翼序列与已有的橡胶树基因组测序结果进行比对分析,发现该插入位点处并不存在基因,根据CBF1与Ca MV35s启动子的研究推测,C1植株的矮化表型是由于Ca MV35s启动子驱动抗逆基因导致,而非插入基因造成。 相似文献
14.
为调查分析我国的常规大豆育种材料中是否混入转基因大豆品系,选取706份大豆品系,对可能含有的
外源转基因调控元件（CaMV35S启动子、FMV35S启动子和NOS终止子）以及针对我国批准进口的主要耐除草剂转
基因大豆转化体（GTS40-3-2和MON89788）成分进行PCR扩增,同时根据MON89788转化体侧翼序列和目的基因
设计引物做特异性检测,为其定性检测提供技术支撑。结果表明,在选取的所有样品中,最终测得含有CaMV35S启
动子的转基因成分所占比例为1％,含有FMV35S启动子的转基因成分所占比例为0.85％,含有NOS终止子的转基
因成分所占比例为0.71％,耐除草剂转基因品系MON89788所占比例为0.85％,以此评估转基因大豆所占比例,为
农业转基因监管部门开展转基因大豆监管工作提供数据支持。 相似文献
15.
华南农业大学根系生物学研究中心采用拟南芥的紫色酸性磷酸酶基因AtPAP15转化大豆品系粤春03－3（YC03-3）,获得了酸性磷酸酶活性明显提高、可高效利用土壤磷素的转基因大豆新品系AP15-1。以AP15-1为研究对象,应用TAIL－PCR技术,根据载体序列设计特异引物,获得了转化载体左侧插入的旁邻序列。设计事件特异性检测引物,进行PCR扩增,只能在AP15-1的样品中扩增出特异性条带,进一步用实时荧光定量PCR作分析,结果显示,该引物对重复性好,融解曲线显示只有一个特异峰值。本实验应用该引物对建立的检测方法,检测的灵敏度可以达到0.01%,实时荧光定量PCR检测的极限值可以达到9个基因组的拷贝数,能够满足对转基因大豆新品系AP15-1及其衍生品种检测的需要。 相似文献
16.
通过农杆菌介导的方法用富赖氨酸蛋白基因（sb401）转化粳稻品种日本晴,获得了独立的10个转化株系,对转化株系进行连续自交,通过筛选得到9个纯合的T4代转化株系。 Southern blotting分析发现,整合位点是随机的,并为低拷贝（1~3个）。TAI-PCR扩增得到8个T-DNA侧翼序列,并定位于日本晴的7条染色体上。蛋白质和氨基酸测定分析发现,sb401基因对各株系的蛋白质、赖氨酸和其他氨基酸组分的提高起到了一定的作用。将杂交结果与T-DNA插入位置结合分析发现,在低拷贝的情况下,表达量的差异不明显。 相似文献