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为分析近年来天津地区养殖鲤(包括锦鲤)暴发性死亡的病因,利用病原菌分离、细胞培养、电镜观察、组织病理切片、人工感染实验、PCR和荧光定量PCR检测、基因分型等方法对患病鱼及病原进行了研究。结果显示,在患病鱼体表未发现大量寄生虫;在肝、脾、肾等内脏组织中未能分离到细菌;在鳃组织中发现大量的圆形病毒颗粒;使用患病鱼组织滤液感染锦鲤鳍条原代细胞,可观察到典型的细胞病变效应(CPE),注射患病鱼组织滤液和产生病变的细胞上清液可分别导致健康锦鲤93.3%和86.7%的死亡率;通过病理组织切片观察,主要病变组织为鳃、肝脏和肾脏。采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测方法进行PCR检测发现KHV呈阳性,且KHV在鳃组织中含量最高,肾脏次之,脑组织中最少。结合TK基因全长序列建立系统进化树和基因型分析,证实此次分离到的KHV为亚洲型毒株,属于I++II–基因型,将其命名为KHV-TJ1601株。这是我国华北地区首次报道KHV I++II–基因型的存在,可为KHV的进化分析和疫苗制备提供基础资料。 相似文献
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锦鲤疱疹病毒病 总被引：4，自引：0，他引：4
<正>锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus disease,KHVD)是20世纪末被确定的一种疾病,现已流行于世界各地,是严重威胁鲤和锦鲤养殖业安全的一种疾病,世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的疾病,我国将其列为二类疫病。一、病原学病原是锦鲤疱疹病毒(K o i herpes virus,KHV),暂列为疱疹病毒科(Herpesviridae),鲤疱疹病毒属(Cyprinid herpesvirus),又称鲤疱疹病毒Ⅲ型(CyHV-Ⅲ),与鲤痘疮病毒(鲤疱疹病毒Ⅰ型,CyHV-Ⅰ)和金鱼造血器官坏死病毒(鲤疱疹病毒Ⅱ型,CyHV-Ⅱ)同属。KHV和CyHV-Ⅰ存在交叉的抗原反应。KHV是球状病毒,成熟病毒颗粒有囊膜,直径约170nm～230nm。核衣壳为对称十面体,直径100nm～110nm,由31种病毒多肽组成,其中21种多肽分子量与鲤疱疹病毒相似,10种多肽与斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)相似。KHV含有双链DNA,基因组大小约为277kb,比疱疹病毒科的其他病毒基因组(250kb)大。二、流行病学目前该病流行范围已遍及欧亚美非各大洲的以色列、英国、德国、美国、南非、日本、韩国、中国、马来西亚、新加坡、印度尼西亚等国家,并在部分国家造成危害。1998年5月,该病在以色列首次发生,随后18个月内连续发生三次,造成以色列600吨食用普通鲤和400万美元出口锦鲤的损失。使以色列鲤和锦鲤养殖业遭受毁灭性打击。2002年4月印度尼西亚养殖锦鲤和鲤暴发该病,损失500万美元。2003年10月日本10余个县暴发该病,造成近千吨的鲤和锦鲤死亡。KHV的严重危害引起国际动物卫生组织(OIE)和世界粮农组织(FAO)的高度关注。KHV仅仅感染锦鲤、鲤和剃刀鱼(Solenostomus paradoxus)。其鱼苗、幼鱼、成鱼,均可感染。KHV发病最适温度是23℃～28℃(低于18℃,高于30℃不会引起死亡)。若鱼已感染KHV,水温18℃～27℃间持续时间越长,疾病暴发的可能性越大。该病多发于春、秋季,潜伏期14天,鱼发病并出现症状24小时～48小时后开始死亡,开始死亡至2天～4天内死亡率可迅速达80%～100%。KHV暴发后幸存的鱼成为疾病的传播者,可将病毒传染给其他健康的鱼。KHV主要通过水平传播,能否垂直传播目前尚未确定。三、临床症状病鱼停止游泳,鱼眼凹陷,皮肤上出现苍白的块斑与水泡, 相似文献
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锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定 总被引：3，自引：2，他引：1
2013年4月,广东省一锦鲤养殖场暴发不明病因疾病,濒死锦鲤在塘边游动缓慢直至死亡,死亡率高达100%。现场采样发现,发病锦鲤体长25 cm,眼球凹陷,胸鳍及腹鳍出现出血斑点,解剖发现内脏器官包括肝、脾、肾肿大。细菌分离结果显示,内脏器官肝脏和肾脏中未分离到细菌。提取自然发病鱼的肝、脾、肾、鳃组织DNA作为模板,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的锦鲤疱疹病毒(KHV)检测引物进行PCR扩增,均能扩增出预期大小的特异性产物。NCBI的Blast搜索结果显示,扩增序列与KHV胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因核苷酸序列同源性为99%。病鱼内脏组织研磨过滤除菌后,腹腔注射20尾锦鲤,可复制出与自然发病相似的症状,并于7 d内全部死亡。取病鱼的鳃和肾脏研磨过滤除菌后进行细胞感染实验,结果显示,组织滤液感染CCB细胞后,盲传5代可以观察到典型的细胞病变效应(CPE)。将出现典型CPE的CCB细胞进行超薄切片制备和电镜观察,电镜下病毒呈对称20面体,直径约100 nm。将出现典型CPE的细胞进行间接免疫荧光实验,可以观察到特异性荧光。根据TK基因全长序列建立系统进化树,证实该毒株为KHV亚洲型毒株,暂命名为KHV-GZ1301株。研究结果可为KHV起源进化、分类以及疾病防控提供重要材料。 相似文献
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锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)引起的一种传染性疾病,主要是引起各生长阶段鲤鱼、框镜鲤、锦鲤等鳃坏死及间质性肾炎,死亡率高达60%～100%,疫情难以控制,已引起各国的高度关注。1998年锦鲤疱疹病毒病首次在以色列暴发,并迅速扩展至世界各地。2002年首次证实该病已传至 相似文献
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为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白(KHV-MEP)的功能及锦鲤疱疹病毒(KHV)的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤(Cyprinus carpio Koi)肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段.将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件Tmpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2.所获得的基因片段大小为771 bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因(AB178537)的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点(PI)为8.65.该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇.结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因. 相似文献
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为建立并优化锦鲤疱疹病毒检测方法,针对目前国内集约化养殖鲤鱼大面积流行的病死现象进行有针对性的检测,对在疫区采集到的病鱼肾脏、肝胰脏、肠等组织,提取基因组DNA,应用锦鲤疱疹病毒特异性引物进行PCR反应,同时设立阴性对照(TE buffer)。通过1%琼脂糖凝胶进行鉴定,与阴性对照比较,在484bp处出现特异性目的条带。经序列测定,所得PCR产物的基因序列与NCBI上锦鲤疱疹病毒的同源率达到99%以上。对同一批次的样品进行重复检测,结果表明该方法具有较好的可重复性,可据此判定结果。通过对锦鲤疱疹病毒的检测,确定了疫区引起框镜鲤(Cyprinus carpio)和建鲤(Cyprinus carpio var Jian)大批死亡的病原为锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV),从而对疫区控制、防治方案的制定提供了理论依据。建议尽快在鲤鱼主要养殖区开展KHV流行病学、诊断与检测及免疫预防等方面的研究。 相似文献
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锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
本文根据锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(Single cross priming amplification,SCPA)进行扩增及优化反应体系,并结合核酸试纸条技术(Nucleic acid test strip detection method),建立了快速可视化检测锦鲤疱疹病毒的单交叉引物等温扩增检测方法(KHV-SCPA)。KHV-SCPA法可在63℃下60min内实现循环扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带,可特异性地检测出KHV,灵敏度较之常规PCR方法提高约1000倍。结合核酸试纸条检测技术,在3~5min内可对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。 相似文献
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白山市鸭绿江网箱养鲤冰下爆发锦鲤疱疹病毒病的鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
锦鲤疱疹病毒病(Kio herpesvirus disease,KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)引起的鲤(Cyprinus carpio L)、锦鲤、框镜鲤的一种高传染率和致死率的疾病,发病季节多为春秋季,常发水温为18~28℃。2015年3月初,低温条件下,吉林省白山市鸭绿江某网箱养殖场鲤鱼大量死亡,其因不明。本实验采用PCR方法进行鉴定,对其编码的膜糖蛋白基因ORF25和囊膜蛋白ORF81基因进行检测,测序结果显示该病毒的目的基因片段与KHV-cj同源性达96%。综上所述,可判定该养殖场鲤爆发的疾病为锦鲤疱疹病毒病。目前该病在低温下爆发的报道还比较少,因此本实验为锦鲤疱疹病毒病爆发的温度条件提供了参考,同时也为该病的防治提出了一些措施及建议。 相似文献
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为了进一步研究锦鲤疱疹病毒主要囊膜蛋白（KHV-MEP）的功能及锦鲤疱疹病毒（KHV）的感染机制,根据KHV-MEP基因序列设计并合成1对引物,从自然感染KHV发病的锦鲤（Cyprinus carpio Koi）肝组织总DNA中扩增获得特异性基因片段。将所得基因片段克隆到pMD18-T Simple Vector载体中,获得重组质粒T-KMEP;酶切鉴定后进行序列测定,并采用氨基酸亲水性分析软件TMpred对其编码氨基酸序列进行分析;在对该片段所编码氨基酸可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,获得重组表达载体pBV-KMEP1和pBV-KMEP2。所获得的基因片段大小为771bp,该基因片段与GenBank中已登录的KHV-MEP基因（AB178537）的同源性为100%,是一个完整的开放阅读框,所编码的蛋白由256个氨基酸组成,分子量为28.2kD,等电点（PI）为8.65。该序列含有4个跨膜区,可构成主要抗原决定簇。结果显示所获得的目的基因片段就是锦鲤主要囊膜蛋白全基因。 相似文献