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以分离于病(死)牙鲆(Paralichthys olivaceus L.)的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的代表菌株(T030817-1株),分别制备全菌(OK)及热处理(121℃作用1h)菌体(O)免疫原,强化免疫接种家兔制备相应抗血清,对10株格氏乳球菌分离株进行了血清同源性检验。结果表明,供试10株菌均存在同种的表面K抗原和同种的菌体O抗原(血清同源),其中O抗原具有强免疫原性、K抗原免疫原性及O凝集抑制阻断作用弱;以相应OK抗血清为第1抗体、标准的羊抗兔IgG荧光抗体为第2抗体,对10株格氏乳球菌的纯培养物及用代表菌株(T030817-1)人工感染病死牙鲆的肝组织进行了间接荧光抗体染色,结果显示了特异的荧光反应;同时,对从人工感染死亡牙鲆分离的6株纯培养菌以凝集试验进行了检验,亦显示特异凝集反应。 相似文献
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为了能够成功表达虹鳟IgM,本研究利用生物信息学软件对虹鳟IgM的亲水性及抗原性进行了分析,根据GenBank收录的虹鳟IgM重链恒定区,参照生物信息学分析结果,设计用于扩增截短的IgM基因的引物,以虹鳟头肾RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增虹鳟截短的IgM重链恒定区部分基因片段,连接原核表达载体pET-27b,利用大肠杆菌Rosetta进行表达。SDS-PAGE及HPLC结果显示,纯化后截短的IgM大小约为47.7 ku,且纯度达到90%。利用其制备兔抗血清后ELISA分析结果显示,所制备的兔抗血清与本研究所表达的截短IgM蛋白的反应效价为1∶40 000,与虹鳟血清提取的全长IgM反应效价为1∶20 000并且呈现出抗原计量依赖性。研究表明,重组IgM蛋白与虹鳟血清中的天然IgM重链恒定区具有近似的结构,利用其所制备的兔抗血清能够与虹鳟鱼体中的天然IgM发生特异性反应。 相似文献
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酶联免疫吸附方法分析海水和贝类中的滴滴涕及代谢物 总被引：2，自引：0，他引：2
采用间接竞争酶联免疫吸附分析(Ind irect Competitive Enzym e-linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法测定海水样品和海洋贝类中的有机氯农药滴滴涕及其主要代谢产物的含量。采用碳二亚胺法,将半抗原DDA分别与载体蛋白牛血清白蛋白(Bovine serum album in,BSA)和卵清蛋白(Ovalbu-m in,OVA)偶联,得到包被抗原和免疫抗原。以DDA-OVA作为免疫抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,免疫数次后,测定血清中抗体效价。以DDA-BSA为包被抗原,免疫多克隆抗血清为多克隆抗体,建立间接竞争酶联免疫吸附方法分析检测海水样品和海洋贝类中的有机氯农药二氯二苯三氯乙烷(DDT)及其代谢产物2,2-双(4-氯苯基)乙酸(DDA)、2,2-双(4-氯苯基)-1,1-二氯乙烷(DDD)、2,2-双(4-氯苯基)-1,1-二氯乙烯(DDE)的方法。最低检出限分别为DDT:25 ng/m l,DDA:1.56 ng/m l,DDD:25 ng/m l,DDE:25 ng/m l。贝类样品DDA回收率为96.37%~100.88%,批内变异系数为2.28%~5.13%;贝类样品DDT回收率为93.86%~100.08%,批内变异系数为4.71%~7.68%;海水样品DDT回收率88.23%,批内变异系数6.60%。 相似文献
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目的建立一种敏感、特异、快速的O型口蹄疫病毒抗体检测方法。方法以O型口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1和HRP标记VP1兔抗血清为原料,通过方阵滴定试验确定ELISA的反应条件以及阈值,建立直接竞争ELISA检测方法 ,并运用该方法检测已知临床阴阳性样品。结果 VP1抗原包被浓度为50ng/μL;HRP标记抗血清工作浓度为1:2000;抑制率大于30%为阳性,抑制率小于30%为阴性;检测120阳性临床血清,阳性检出率为90.8%;检测120份阴性临床血清,阴性检出率为93.3%。结论研究建立的直接竞争ELISA方法操作简单,能够用于检测口蹄疫病毒O型抗体VP1抗体。 相似文献
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传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的原核表达及抗原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
应用RT-PCR方法扩增了IPNV编码内衣壳VP3蛋白的基因615bp,将VP3基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌BL21中得到了表达。通过SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小约30ku的VP3蛋白,与理论值相符,经薄层扫描分析表明目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的30%。用镍离子亲和层析柱纯化可溶性的VP3蛋白,并制备抗血清。Western-blotting结果显示,VP3蛋白可被兔抗IPNV阳性血清识别;间接ELISA结果显示,IPNV细胞培养物作为抗原,兔抗VP3蛋白高免血清稀释度为1∶25600时,P/N>2,抗血清可与IPNV全病毒发生反应,以上两项结果说明,表达的VP3蛋白与天然的IPNVVP3蛋白一样具有相同的抗原性。试验利用原核表达系统成功地高效表达了IPNVVP3蛋白,融合蛋白以可溶性形式存在,并制备了高效价的抗血清。 相似文献
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应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)感染的细胞悬液克隆病毒的糖蛋白基因,将其亚克隆至原核表达载体pCWori,转化到大肠杆菌DH 5α,通过发酵大肠杆菌制备病毒糖蛋白.经SDS-PAGE分析,诱导表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,使用Ni-NTA亲和层析柱在变性条件下进行纯化并透析复性,最终得到了较高纯度的可溶性糖蛋白,分子量约为57 kDa.Western-blot分析结果显示,所表达的蛋白能够被IHNV病毒制备的兔抗IHNV血清识别.用复性后的蛋白免疫小鼠制备抗血清,ELISA显示抗体效价可达1∶64 000.经制备的抗血清可以作为一抗建立ELISA检测方法,用于检测细胞悬液的病毒粒子,将抗血清稀释到1∶16 000仍能与IHNV全病毒发生反应.本研究利用重组的IHNV糖蛋白成功制备了高效价的抗血清,并能够与IHNV全病毒发生特异性结合,为IHNV免疫学检测方法建立奠定了基础. 相似文献
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黄鳍棘鲷血清IgM的纯化及兔抗血清的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
分别采用Sepharose-6B凝胶过滤层析、Phenyl Sepharose FF疏水作用层析和rProtein A Sepharose亲和层析技术纯化黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）血清IgM，并将这3种层析纯化方法进行了比较。纯化产物进行SDS—PAGE，电泳结果扫描后经Band Scan5．0软件分析显示，单独使用Sepharose-6B凝胶过滤层析或Phenyl Sepharose FF疏水作用层析得到的IgM纯度只有56％左右；二者联合使用纯度可以达到69％，而rProtein A Sepharose亲和层析一步就可以达到89％的纯度；纯化得到的黄鳍棘鲷血清IgM的重链和轻链分子量分别为73．6kD和26．5kD。本研究还以rProtein A Sepharose亲和层析纯化的黄鳍棘鲷血清IgM为抗原，制备其兔抗血清，采用Western Blot和双向琼脂扩散检测抗血清免疫学活性，并用间接ELISA检测其效价达到1：25600，为进一步开展黄鳍棘鲷免疫学方面的研究奠定了基础。 相似文献
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为了从对虾体内分离出的菌株中快速筛选出蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌,将蜡样芽孢杆菌与溶藻胶弧菌作为抗原,免疫SPF新西兰大白兔,获得免疫血清,效价均高于1:2000。将免疫兔血清作为一抗,HRP-羊抗兔血清作为二抗,建立了蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌快速检测的间接ELISA方法。此方法中,兔抗血清最佳稀释度为1:10000,菌液最佳包被浓度为106 CFU/ml;HRP-羊抗兔血清最佳稀释浓度为1:1000,可检测细菌最低浓度为104 CFU/ml。抗蜡样芽孢杆菌血清与苏云金芽孢杆菌有交叉反应,抗溶藻胶弧菌血清与其亲缘相近菌株无交叉反应,具有较强的特异性。2012年和2013年,分别从斑节对虾、中国对虾、凡纳滨对虾等9批样本中分离纯化到109株海洋细菌,利用建立的多抗间接ELISA方法对其中部分菌株进行快速检测,共检测出6株溶藻胶弧菌,未检测出蜡样芽孢杆菌。 相似文献
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注射同种异体性腺(抗原)提取液于成熟鲤鱼体内,2、4、6、8周后所得免疫血清与精子的凝集反应均为阳性,且随着注射次数的增加和间隔时间的延长,血清中抗体的含量逐渐增加. 相似文献
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应用间接荧光抗体技术检测林蛙嗜水气单胞菌 总被引：1，自引：0，他引：1
以感染嗜水气单胞菌的林蛙各组织脏器为抗原,以热灭活的嗜水气单胞菌为免疫原,免疫家兔制备兔抗嗜水气单胞菌血清为第一抗体,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG作为二抗,建立了间接荧光抗体试验方法.分别采用2.5%戊二醛5 min、甲醇10 min、冷丙酮1 h 3种固定方法固定抗原,然后滴加不同稀释倍数的兔抗嗜水气单胞菌血清、羊抗兔IgG-FITC,于荧光显微镜下观察.结果表明,2.5%戊二醛固定腹水5 min,兔抗血清抗体效价为 1:80,荧光二抗的最佳稀释倍数为1:4000. 相似文献
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采用活化酯法将大田软海绵酸(OA)与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联制备免疫抗原(OA-KLH),用还原聚丙烯酰胺凝胶电泳法和红外光谱法对人工抗原的偶联效果进行分析,通过免疫兔子制备抗体,所得抗血清经Protein A凝胶层析柱纯化处理后,用紫外全波长扫描和间接竞争ELISA法验证纯化效果。结果表明,免疫抗原偶联成功并获得了高亲和力的多克隆抗血清,抗血清纯化后浓度为2.16 mg/mL,间接竞争ELISA测定其滴度为12 800、IC15为3.41 ng/mL,为建立快速、经济的检测方法打下了基础。 相似文献
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以传染性造血器官坏死病毒Sn1203株(IHNV-Sn1203)基因组RNA提取物为模板,利用生物信息学软件分析,通过RT-PCR一步法扩增截短的G蛋白基因序列(约375 bp),将其克隆到表达载体p ET-27b中,构建重组表达质粒p ET-27b-IHNV-short G,通过大肠杆菌Rosetta表达菌株获得高效表达。在IPTG浓度为0.25 mmol/L时,37℃诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白相对分子质量约为14 000,符合预期大小,并以包涵体的形式表达,4 h时目的蛋白表达量最大。蛋白经变性、复性处理后获得不带任何标签的纯化蛋白,并利用该蛋白制备兔抗血清。ELISA结果显示,兔抗血清的效价为1∶80 000,说明制备的兔抗血清能够识别表达的重组蛋白;间接免疫荧光结果表明兔抗G蛋白血清具有良好的特异性,并且与VHSV参考毒株没有任何交叉反应。 相似文献
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渔药恩诺沙星完全抗原合成方法及效果的研究 总被引：4，自引：0，他引：4
采用牛血清白蛋白（BSA）和鸡血清白蛋白（OVA）为免疫用载体蛋白,匙孔血蓝蛋白（KLH）为包被抗原用蛋白,采用不同的方法合成完全抗原,对BALB／C小鼠进行免疫,并通过紫外光谱特征、抗血清检测等手段对完全抗原的合成效果进行了分析。实验表明蛋白-恩诺沙星偶联物的紫外光谱特征可以较为准确、简便地提示完全抗原的合成效果,并能够与抗血清的酶联免疫吸附试验（ELISA）分析结果吻合。用乙二胺（EDA）对载体蛋白进行处理,可以明显提高完全抗原的合成效果;而偶联方法对于不同载体蛋白的影响也存在差异,OVA采用活化酯法效果较好,而BSA采用碳二亚胺法得到的血清效价较高。 相似文献
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随着人们对动物源性食品质量卫生安全要求的日益提高和动物防疫检疫工作的需要,实验室检验成为基层动物防控机构的必要技术手段.而细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等不溶性的颗粒抗原,当与相应抗体结合,在有电解质存在时,抗原与抗体结合形成凝集团块,即称为凝集试验.凝集试验中的抗原称为凝集原,抗体称为凝集素.凝集试验主要包括直接凝集试验和间接凝集试验,其共同特征是操作简便,反应快速,敏感性高;缺点是容易发生非特异性反应.所以在做凝集试验时,必须设置阴性血清、阳性血清和生理盐水等对照.以排除非特异性凝集. 相似文献
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采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )cDNA ,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX 4T 1载体中 ,构建草鱼IGF I融合蛋白表达质粒pGEX IGF。质粒转化大肠杆菌BL2 1菌株。该菌株经IPTG诱导可表达分子量约 34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白。经 30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后 ,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF I的抗血清。凝胶双扩散试验显示抗血清效价为 1∶6 4 ,说明表达产物具免疫原性 相似文献
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采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-I（IGF-I）cDNA。使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-I融合蛋白表达质粒pGEX-IGF。质粒转化大肠杆菌BL21菌株,该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白,经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathione sepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-I的抗血清,凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1：64,说明表达产物具免疫原性。 相似文献
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草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ的融合表达、纯化和抗血清制备 总被引：2，自引：0，他引：2
采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-Ⅰ融合蛋白表达质粒pGEX-IGF.质粒转化大肠杆菌BL21菌株.该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白.在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白.经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF.以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-Ⅰ的抗血清.凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1:64,说明表达产物具免疫原性. 相似文献
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以施氏鲟(Acipenser schrenckii)肿嘴病病原菌异常嗜糖气单胞菌(A.allosaccharophila)为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测施氏鲟肿嘴病病原菌的ELISA技术。结果显示:采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别是为107CFU和1∶100000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应均呈阴性;阻断试验中的阻断率达67.3%;交叉反应和阻断试验的结果表明该方法具有较高的特异性。将此方法标准化后,对35份人工感染后的施氏鲟和健康施氏鲟进行检测,阳性的检出率分别为88.6%和14.3%,表明该技术不但可以检测已经发病的施氏鲟,而且还可以检测带菌的施氏鲟。 相似文献