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本文旨在探讨miRNA-218-5p对兔毛乳头细胞毛囊发育相关基因的影响,为研究家兔毛囊发育中的作用机制提供理论依据。用酶消化法分离兔毛乳头细胞,用MSCM培养基培养毛乳头细胞。将培养的毛乳头细胞分为4组,分别转染miR-218-5p mimics、miR-218-5p mimics NC、miR-218-5p inhibitor、miR-218-5pinhibitorNC。培养48h后,收集细胞。使用RNA提取试剂盒提取各组RNA,使用RT-qPCR检测各组miR-218-5p的mRNA表达水平和毛囊生长发育相关基因表达水平。使用CCK-8检测各组细胞增殖情况。结果发现,在兔DPCs(Dermal Papilla Cells)中过表达miR-218-5p能够显著上调毛囊生长发育相关基因如CCND1、CTNNB1、LEF1的mRNA表达水平,显著下调TGF-β1、BMP4的mRNA表达水平;敲减miR-218-5p能够显著下调毛囊生长发育相关基因如CCND1、CTNNB1、LEF1的mRNA表达水平,显著上调TGF-β1、BMP4的mRNA表达水平。过表达miR-218-5p后,极显著... 相似文献
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旨在探究miR-144-5p靶向WNT5a对山羊颗粒细胞增殖和凋亡的影响。本研究选用2岁健康雷州母山羊的卵巢颗粒细胞来过表达和抑制表达miR-144-5p及WNT5a,通过荧光定量PCR(real-time qPCR, RT-qPCR)、Western blot、双荧光素酶报告基因、CCK-8等技术来探究miR-144-5p与WNT5a对颗粒细胞增殖和凋亡的影响。结果表明，miR-144-5p在大卵泡颗粒细胞中的表达量极显著高于小卵泡颗粒细胞(P<0.01),WNT5a在大卵泡颗粒细胞中的表达量极显著低于小卵泡颗粒细胞(P<0.01);CCK-8检测发现，miR-144-5p抑制了GCs增殖，过表达miR-144-5p后，抑凋亡基因BCL-2的mRNA和蛋白表达极显著下调(P<0.01),促凋亡基因BAX的mRNA和蛋白表达极显著上调(P<0.01);Wnt/β-Catenin通路CTNNB1 mRNA和β-Catenin蛋白水平极显著降低(P<0.01);另外，miR-144-5p能靶向WNT5a抑制其表达。同时，CCK-8检测结果表明，WNT5a可促进... 相似文献
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旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。 相似文献
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以贵州黑山羊为研究对象，通过生物在线软件预测调控CTSK基因表达的候选miRNAs,采用荧光定量PCR法检测CTSK及其候选miRNAs在贵州黑山羊单、多羔性腺轴下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫体及子宫角6种组织中的表达量。结果：CTSK在单、多羔贵州黑山羊的6个组织中均有表达，在单羔组中表达量依次为子宫角>输卵管>卵巢>子宫体>垂体>下丘脑，其中在子宫角中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),在多羔组中，其表达量依次为子宫体>输卵管>子宫角>卵巢>垂体>下丘脑，其中子宫体的表达量显著高于其他组织(P<0.05);组间比较可知，CTSK基因在多羔组子宫体中的表达量极显著高于单羔组(P<0.01),卵巢中的表达量极显著低于单羔组(P<0.01)。在线软件预测结果表明：miR-122、miR-205、miR-7、miR-30-5p和miR-124为调控CTSK表达评分最高的5条miRNAs。qPCR结果表明：5条miRNAs在子宫体和卵巢中均有表达，在子宫体中，单羔组和多羔组的表达量均依次为miR-12... 相似文献
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《中国畜牧杂志》2020,(7)
颗粒细胞是卵巢中必需的体细胞,在卵泡发育过程中起重要作用。为探究miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响,本实验中2个处理组分别转染miR-10b模拟物(miR-10b mimics)和miRNA模拟物(mimics NC),转染48h后,通过Quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测内源miR-10b表达量,明确miR-10b mimics转染成功。利用qRT-PCR和Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达量的变化;利用流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果显示:与mimics NC组相比,miR-10b mimics组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著降低,Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著升高;同时miR-10b mimics组的细胞凋亡率较mimics NC组显著升高。结果表明,miR-10b可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡。 相似文献
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【目的】 研究miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞增殖分化的影响及其在不同组织中的表达情况,为探究miRNA在肌肉发育中的调控机制提供理论基础。【方法】 利用生物信息学方法预测miR-495-3p的靶基因;实时荧光定量PCR检测miR-495-3p及其靶基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌等组织中的表达水平。构建miR-495-3p的过表达(miR-495-3p mimic、miR-495-3p mimic NC)及抑制物(miR-495-3p inhibitor、miR-495-3p inhibitor NC),在山羊骨骼肌细胞汇合度达60%~70%时进行转染,并用含2%马血清的培养基进行诱导分化,用CCK-8检测细胞增殖活力,实时荧光定量PCR检测过表达和干扰效率及增殖分化相关基因配对盒基因(paired-box 7,Pax7)、细胞蛋白周期E(Cyclin E)、肌细胞生成素(myogenin,myoG)、生肌因子5(recombinant myogenic factor 5,Myf5)的表达;构建miR-495-3p靶基因的野生型和突变型载体并转染至293T细胞,用双荧光素酶测定miR-495-3p与其靶基因的结合情况。【结果】 生物信息学预测结果表明,miR-495-3p的靶基因为心肌肌动蛋白α1(alpha cardiacactin 1,ACTC1),且miR-495-3p和ACTC1在1和10月龄山羊背最长肌中表达量均差异极显著(P<0.01)。miR-495-3p和ACTC1在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌6种组织中均有表达,在背最长肌中表达量较高。细胞转染结果表明,miR-495-3p mimic极显著促进miR-495-3p的表达(P<0.01),miR-495-3p inhibitor极显著抑制miR-495-3p的表达(P<0.01),说明miR-495-3p mimic和miR-495-3p inhibitor可用于后续试验。实时荧光定量PCR结果表明,过表达miR-495-3p促进骨骼肌细胞分化相关标志基因MyoG、Myf5的表达,抑制miR-495-3p则降低MyoG、Myf5基因的表达;过表达、干扰miR-495-3p对Pax7、Cyclin E基因的表达及细胞增殖活力均无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶报告结果表明,miR-495-3p与ACTC1基因存在靶向关系。【结论】 miR-495-3p对山羊骨骼肌细胞的增殖无显著影响,但可通过靶向ACTC1基因促进山羊骨骼肌细胞分化。 相似文献
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旨在探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的影响。本试验收集180日龄健康母猪的卵巢组织,每次试验取20对卵巢进行颗粒细胞的分离培养,将miR-24-3p的mimics及inhibitor转染进颗粒细胞,通过ELISA、RT-qPCR、Western blot、双荧光素酶报告试验等技术探究miR-24-3p对猪颗粒细胞雌二醇合成的作用。结果表明,过表达miR-24-3p可显著促进雌二醇的合成(P<0.01),并加快StAR、CYP19A1和CYP11A1的转录和翻译(P<0.05);而干扰miR-24-3p则显著抑制雌二醇的合成(P<0.05),并显著下调CYP11A1、CYP19A1的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。进一步研究发现,TOP1是miR-24-3p的直接靶基因,过表达miR-24-3p可显著抑制TOP1的表达(P<0.05),干扰miR-24-3p可显著上调TOP1的表达(P<0.05)。而过表达TOP1则可减弱miR-24-3p对颗粒细胞雌二醇合成的促进作用(P<0.05)。综上所述,miR-24-3p通过靶向TOP1... 相似文献
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实验旨在探究生长分化因子9(Growth Differentiation Factor,GDF9)基因对番鸭颗粒细胞的影响，本研究构建了GDF9过表达载体（pEX-2-GDF9）以及干扰GDF9小RNA (siRNA-GDF9-530、siRNAGDF9-978、siRNA-GDF9-1320)，分别转染至原代番鸭颗粒细胞内，通过流式细胞术检测GDF9基因对细胞周期和凋亡的影响；荧光定量PCR技术检测转染后颗粒细胞周期和凋亡相关基因的表达量。结果显示，过表达GDF9基因将番鸭颗粒细胞阻滞在G0/G1期，S期细胞极显著减少，且Bax基因和Caspase-3基因表达量极显著（或显著）上调，说明过表达GDF9促进了颗粒细胞凋亡；干扰GDF9基因表达后，G0/G1期细胞极显著减少，S期细胞极显著增加，且CDK-2、Bcl-2、CCND1 mRNA极显著上调，CCNE1 mRNA显著上调。综上可知，GDF9基因表达促进颗粒细胞凋亡、抑制细胞周期进程。该结果可为番鸭的卵泡发育机制研究提供理论基础。 相似文献
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【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA），转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）；GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol；双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01），但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞（0 d）相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05），到第6天达到极显著差异（P<0.01）；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01），inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01），inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）；mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05；P<0.01），inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）；油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。 相似文献
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【目的】研究miR-140-5p在前脂肪细胞（3T3-L1）成脂分化过程中的功能及其作用机制。【方法】待3T3-L1细胞汇合度达100%时诱导其成脂分化，收集分化第―1（诱导分化前1 d）、0、1、2、3、5、7天的细胞，用实时荧光定量PCR检测miR-140-5p相对表达量；将miR-140-5p mimics、NC转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）、CAAT增强子结合蛋白δ（C/EBPδ）与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）相对表达量；利用miRandn和TargetScan在线网站预测miR-140-5p的靶基因；通过对比序列差异分析P300/CBP相关因子（PCAF）的3'-UTR序列中与miR-140-5p的结合位点序列在小鼠、人等不同物种间的序列保守性。将miR-140-5p mimics、inhibitor、NC转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化，实时荧光定量PCR检测miR-140-5p、PCAF相对表达量，Western blotting检测PCAF蛋白水平；将PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1转染3T3-L1细胞，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测PCAF、C/EBPδ、PPARγ基因相对表达量，Western blotting检测C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ蛋白表达水平。将3条PCAF siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）、siRNA NC转染3T3-L1细胞，Western blotting法检测PCAF蛋白水平，筛选最佳PCAF siRNA。将最佳PCAF siRNA和siRNA NC转染3T3-L1细胞，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ与PPARγ基因相对表达量，Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ蛋白表达水平。分别将miR-140-5p mimics、NC与PGL0-PCAF 3'-UTR载体和PGLO空载体共转染293T细胞，用双荧光素酶报告试验检测miR-140-5p与PCAF的靶向关系。【结果】在诱导3T3-L1细胞成脂分化过程中，与诱导分化前1 d相比，在细胞成脂分化第1、2天时miR-140-5p相对表达量极显著升高（P＜0.01），在分化第3天时显著升高（P＜0.05）。与NC组相比，miR-140-5p mimics组脂滴数量明显增加，miR-140-5p mimics组成脂标志基因C/EBPδ与PPARγ相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。靶基因预测结果表明，miR-140-5p与PCAF存在预期结合位点；保守性分析结果表明，靶基因PCAF结合位点序列在不同物种间具有高度保守性。与NC组相比，mimics组miR-140-5p和PCAF相对表达量均极显著升高（P＜0.01），inhibitor组miR-140-5p极显著降低（P＜0.01）、PCAF显著降低（P＜0.05），PCAF蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。与PEGFP-N1组相比，PEGFP-N1-PCAF组脂滴数量增多，PCAF、PPARγ基因相对表达量和C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平极显著升高（P＜0.01），PPARγ蛋白水平显著升高（P＜0.05）。PCAF siRNA1、siRNA2与siRNA3均极显著抑制PCAF蛋白的表达（P＜0.01），siRNA3的效果最显著，因此选择siRNA3进行后续试验。与NC组相比，PCAF siRNA3组3T3-L1细胞中脂滴数量较少，PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因相对表达量和C/EBPβ蛋白水平均极显著下降（P＜0.01）。双荧光素酶报告试验结果显示，miR-140-5p与PCAF基因之间无靶标关系。【结论】内源性miR-140-5p在3T3-L1细胞分化过程中表达升高，miR-140-5p可能通过间接上调PCAF基因表达促进3T3-L1细胞成脂分化。 相似文献
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《畜牧兽医科技信息》2017,(12)
目的:旨在研究miR-27a-3p对黑色素细胞中Scf(stem cell factor)表达的影响,从而明确miR-27a-3p对黑色素生成的影响。方法:将miR-27a-3p mimic(模拟物)、(抑制物)及各自对应的阴性参照物(mimic NC(negative control),inhibitor N C)分别转染绵羊皮肤黑色素细胞,荧光定量PCR和Western Blot测定转染48h后绵羊黑色素细胞中的Scf mRNA和蛋白的表达量。结果:与对照组相比,转染mimic的黑色素细胞中,Scf mRNA和蛋白的表达量都极显著地减少(p0.01),而转染miR-27a-3p inhibitor的黑色素细胞中,Scf mRNA和蛋白的表达量极显著增多(p0.01)。结论:miR-27a-3p抑制绵羊皮肤黑色素细胞中Scf的表达。 相似文献
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【目的】 探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞（RAW264.7）自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】 首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物（miR-145a-3p mimics）和抑制剂（miR-145a-3p inhibitor）及对照模拟物（NC mimics）,转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因（autophagy-related gene 14,ATG14）的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】 miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3'UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3'UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低（P<0.01）。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低（P<0.01）、ATG14蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）,miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调（P<0.01）;布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高（P<0.01）,且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组（P<0.05）。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低（P<0.05）。【结论】 miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。 相似文献
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为了阐明绵羊卵泡颗粒细胞功能调控机制，试验选取不同条件培养的绵羊卵泡壁层颗粒细胞(MGCs)和卵丘颗粒细胞(CCs),分别设置对照组、FSH组和GDF9+FSH组，利用qPCR、Western blot和免疫荧光法分别检测MGCs和CCs中NPPC和NPR2的mRNA和蛋白表达量。结果表明：对于壁层颗粒细胞，FSH组NPPC 12 h mRNA及12,24 h蛋白水平显著高于对照组(P<0.05),极显著低于GDF9+FSH组(P<0.01);体外培养16 h后，与对照组相比，FSH组NPR2 mRNA及蛋白表达水平显著提高(P<0.05),但与GDF9+FSH组差异不显著(P>0.05)。对于卵丘颗粒细胞，FSH组NPPC mRNA及蛋白水平极显著高于对照组和GDF9+FSH组(P<0.01);FSH组NPR2 mRNA及蛋白表达水平显著高于对照组和GDF9+FSH组(P<0.05)。说明FSH可以显著提高体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞中NPPC、NPR2的表达；GDF9可以促进FSH诱导的壁层颗粒细胞中NPPC的表达，但抑制了FSH诱导的卵丘细胞颗粒... 相似文献
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旨在研究oar-miR-127/FOXO4反馈环路及其对绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用Promoter 2.0预测绵羊miR-127启动子,利用JASPAR数据库预测转录因子FOXO4与oar-miR-127启动子区的结合位点,构建包含预测结合位点的pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体;利用TargetScan软件在线预测oar-miR-127与FOXO4基因3'-UTR区结合位点,构建包含预测结合位点的pmir-GLO-FOXO4野生型、突变型和缺失型荧光素酶报告基因重组质粒;将pGL3-basic-miR-127荧光素酶报告载体和pcDNA-FOXO4过表达载体共（或单独）转染体外培养的绵羊卵泡颗粒细胞,FOXO4突变型、野生型和缺失型重组质粒与miR-127 mimic/mimic NC共转染体外培养的293T细胞,48 h后检测荧光素酶活性;pcDNA-FOXO4过表达载体（miR-127 mimic/mimic NC）转染绵羊卵泡颗粒细胞48 h,利用qRT-PCR检测miR-127（FOXO4）及凋亡基因（Casp3、Bax及BCL2）的表达水平。过表达转录因子FOXO4显著降低了oar-miR-127启动子相对荧光素酶活性（P<0.05）和oar-miR-127表达水平（P<0.05）;miR-127 mimic和FOXO4野生型重组质粒共转染的颗粒细胞荧光素酶活性显著低于共转染miR-127 mimic和FOXO4缺失/突变型重组质粒的细胞（P<0.05）。转染miR-127 mimic的颗粒细胞中FOXO4表达量显著降低（P<0.05）,Casp3和Bax基因表达水平极显著升高（P<0.001）;过表达转录因子FOXO4的颗粒细胞中Casp3和Bax的表达水平无显著变化（P>0.05）,但BCL2相对表达量显著降低（P<0.05）。本研究证实了oar-miR-127与靶基因FOXO4间存在反馈环路,并促进绵羊卵泡颗粒细胞的凋亡,为研究其在绵羊卵泡发育中的作用机制奠定了基础。 相似文献
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旨在探究miR-148a-3p是否通过靶基因PPARγ调节鹅卵泡颗粒细胞中类固醇激素的合成。本研究选用12只健康的处于产蛋高峰期的天府肉鹅母系母鹅分别用于组织样品采集和颗粒细胞培养。利用qPCR检测miR-148a-3p在鹅不同阶段卵泡颗粒层中的表达;通过MEGA 7软件分析miR-148a-3p在不同物种的保守性,预测miR-148a-3p的靶基因,采用双荧光素酶报告试验验证miR-148a-3p与靶基因的靶标关系;在鹅颗粒细胞中转染miR-148a-3p mimics和inhibitor,qPCR检测miR-148a-3p对靶基因及其下游基因表达水平的影响;同时利用ELISA技术检测激素含量的变化。结果表明,miR-148a-3p在不同物种中高度保守;在鹅卵泡发育过程中,miR-148a-3p的表达量随卵泡直径的增加呈先升高后下降的趋势。在鹅卵泡颗粒细胞体外培养过程中,miR-148a-3p mimics能显著下调3β-HSD的表达（P<0.05）,抑制孕酮的合成（P<0.05）;而miR-148a-3p inhibitor的作用则相反（P<0.05）。生物信息学分析和双荧光素酶报告试验证实,PPARγ为miR-148a-3p的靶基因。在颗粒细胞中,miR-148a-3p mimics能显著降低PPARγ的表达（P<0.05）,而miR-148a-3p inhibitor能显著上调PPARγ的表达（P<0.05）。当干扰PPARγ后,3β-HSD的表达量显著降低（P<0.05）,孕酮的含量也降低。这些结果表明,在鹅等级卵泡颗粒细胞中,miR-148a-3p可靶向结合PPARγ来抑制3β-HSD的表达,从而降低颗粒细胞孕酮的合成。 相似文献
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《畜牧与兽医》2021,(7)
为揭示miR-215-5p在固始鸡腹部脂肪沉积中的作用机制,本研究采用实时荧光定量PCR,分析了miR-215-5p在14周龄固始鸡8种组织和腹部前脂肪细胞分化过程的表达特征;通过miR-215-5p mimics和inhibitors转染试验,利用CCK-8、EdU、油红O染色、甘油三酯含量测定等方法,分别评价了miR-215-5p对固始鸡腹部前体脂肪细胞增殖和分化的影响。结果表明:miR-215-5p在固始鸡腹脂和皮脂等组织中高表达,在前脂肪细胞分化过程具明显时序表达特征;当转染miR-215-5p mimics后,前体脂肪细胞中增殖标志基因CDK1和PCNA表达水平极显著下降(P0.01)、细胞周期阻滞因子p21表达水平极显著升高(P0.01),EdU阳性细胞比例和前脂肪细胞总数极显著降低;同时,可显著抑制脂肪细胞分化标志基因PPARG、CEBPA、FABP4和LPL的表达,减少脂肪细胞内脂滴生成和甘油三酯含量。与此不同,miR-215-5p inhibitors转染前脂肪细胞后,在增殖和分化上获得与miR-215-5p mimics转染后相反的结果。同时,采用双荧光素酶报告基因系统,验证了mi-R-215-5p的靶基因,过表达miR-215-5p可抑制核受体辅激活因子3 (nuclear receptor coactivator 3, NCOA3)基因3′-UTR区荧光活性,而突变NCOA3基因3′-UTR区与miR-215-5p种子序列的结合位点可解除其抑制效果。上述结果证明,miR-215-5p可抑制固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化,且在脂肪细胞分化过程中直接靶作用于NCOA3。因此,miR-215-5p是固始鸡腹部脂肪形成的一个负调控因子。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(6):1163-1169
使用不同浓度抑制剂对BRL-3A细胞进行不同时间的瞬时转染,利用qRT-PCR检测miR-383-5p相对表达量,筛选出在肝细胞建立miR-383-5p下调表达细胞模型的适宜条件。利用生物能量代谢监测分析仪检测下调miR-383-5p表达对大鼠肝细胞产酸率和氧耗率的影响。结果显示,100 pmol的inhibitor对BRL-3A细胞转染24 h后能够显著降低miR-383-5p的表达量(P0.01),下调miR-383-5p表达可显著提高产酸率和氧耗率(P0.01)。结果表明,miR-383-5p表达下调能够显著促进大鼠肝细胞的氧化磷酸化和糖酵解,可以增强能量代谢。 相似文献
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《畜牧兽医学报》2020,(6)
旨在研究miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖与分化的调节作用。本研究经理论预测和试验研究验证miR-128-1-5p的靶基因;过表达miR-128-1-5p后,用qPCR检测增殖标志基因的表达,CCK-8和EdU检测细胞增殖情况;用qPCR和Western blotting检测miR-128-1-5p和其靶基因在前体脂肪细胞分化中的表达趋势;通过过表达或抑制miR-128-1-5p研究其对绵羊前体脂肪细胞分化的调节机制;用油红O染色检测成脂能力。结果表明,KLF2是miR-128-1-5p的靶基因。前体脂肪细胞增殖过程中,过表达miR-128-1-5p后,增殖标志基因的表达量显著或极显著降低(P0.05或P0.01),细胞活力显著或极显著降低(P0.05或P0.01),新生细胞数显著减少(P0.05)。前体脂肪细胞分化过程中,miR-128-1-5p与KLF2的表达呈负相关;过表达miR-128-1-5p极显著下调了KLF2 mRNA的表达量(P0.01),显著下调了KLF2蛋白的表达量(P0.05),显著或极显著上调了分化标志基因mRNA的表达(P0.05或P0.01),产生更多脂滴;抑制miR-128-1-5p则结果相反。综上所述,miR-128-1-5p与KLF2存在结合位点。miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞的增殖,在分化过程中通过靶向抑制KLF2的表达,促进前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。 相似文献
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体外成熟培养前后山羊卵泡发育相关基因及其受体表达特性的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为研究山羊卵母细胞体外成熟培养前后部分转移生长因子β基因及其受体表达特性,本试验以6~8周龄晋岚绒山羊母羔超数排卵获取的卵丘细胞-卵母细胞复合体为研究对象,应用Real time PCR技术检测成熟培养前后BMP15、GDF9、BMP6及其受体基因BMPRⅡ、TGFβRI和BMPRIB的表达差异。结果显示:山羊卵母细胞体外成熟培养后,卵泡发育相关的基因及受体基因中,BMP6 mRNA表达量显著增加(P0.05),BMPRⅡ、TGFβRI和BMPRIB的mRNA表达量极显著上调(P0.01),Ptgs2基因的表达量极显著下调(P0.01),BMP15和GDF9基因差异不显著(P0.05)。 相似文献