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1.
《动物医学进展》2020,(5)
为获得稳定表达猪源血管紧张素转换酶2(ACE2)的细胞株,用以增殖猪流行性腹泻病毒(PEDV)。构建了稳定表达猪源ACE2的猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2),并对PEDV在该细胞上的增殖进行了分析。将重组表达质粒pCMV3-porcine-ACE2-GFP转染至IPEC-J2细胞后,经潮霉素B筛选和单克隆细胞培养,获得IPEC-J2-ACE2细胞系。通过荧光定量RT-PCR和Western blot对单克隆细胞中ACE2基因的mRNA转录和蛋白表达水平进行鉴定。以PEDV-WH株感染IPEC-J2-ACE2细胞,通过间接免疫荧光试验和荧光定量RT-PCR检测发现,PEDV-WH株在IPEC-J2-ACE2细胞中比在IPEC-J2细胞中的增殖能力高。 相似文献
2.
为构建锚定表达猪IFN-λ3的重组植物乳杆菌(L.plantarum),并验证其抗病毒活性,本研究将猪IFN-λ3基因插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭锚定表达载体pSIP-409-pgsA'中构建重组质粒pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3,将其电转化至植物乳杆菌NC8中获得重组pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum。经清酒乳杆菌素(SPPIP)诱导后用His标签单克隆抗体经westernblot、间接免疫荧光检测目的蛋白的锚定表达情况。结果显示,猪IFN-λ3在重组植物乳杆菌表面锚定表达。利用重组菌刺激细胞后通过荧光定量PCR测定IPEC-J2/PEDV系统中猪流行性腹泻病毒(PEDV)载量,并检测该重组菌刺激细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的相对转录水平。结果显示,该重组菌能够显著抑制PEDV在IPEC-J2中的复制,并能诱导细胞中ISGs(OASL、IFITMs)的高转录水平,具有抗病毒作用。本研究为PEDV的预防和治疗提供可行方案。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2018,(12)
为探究猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染猪小肠上皮细胞(Porcine intestine epithelial cells J2,IPEC-J2)后对IPEC-J2的miRNA表达谱的影响,本实验将PEDV感染IPEC-J2,收获细胞并提取其总RNA,进行Hiseq高通量测序,构建感染组与未感染组的miRNA表达谱并进行聚类分析、GO(Gene ontology,GO)分析、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)代谢通路分析和差异分析,并通过过表达novel-miR-877 mimic和ssc-mi R-219a mimic观察PEDV对IPEC-J2复制的影响。结果显示显著差异表达的已知miRNA有45个,未知mi RNA有249个,从其中随机挑选了差异表达较显著的16个mi RNA并采用q PCR进行验证,结果显示与测序结果一致;对这些差异miRNA进行GO分析,结果显示其广泛参与生物过程、细胞成分和分子功能的调节;通过KEGG代谢通路分析显示miRNA也参与Jak-STAT、Toll样受体等信号通路的调节;通过对novel-miR-877和ssc-miR-219a的过表达,显示PEDV复制均受到显著抑制。本研究为探究miRNA在PEDV复制中的作用奠定了基础。 相似文献
4.
猪流行性腹泻病(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度传染性的猪胃肠道疾病，可导致哺乳仔猪产生急性水样腹泻，造成严重的经济损失。为调查抗菌肽Dermcidin(DCD)对PEDV复制的影响，本研究利用Western blot、荧光定量PCR(RT-qPCR)以及测定病毒半数组织细胞感染量TCID50等方法，通过检测在DCD的作用下PEDV在细胞中的基因转录、蛋白表达和病毒滴度的水平，并利用Western blot检测信号通路中蛋白表达水平，探究其作用的分子机制。研究表明，DCD能够参与PEDV感染；DCD过表达促进了PEDV在Vero细胞和LLC-PK1细胞中的复制，而敲低DCD抑制了PEDV复制；DCD通过诱导PTEN表达来抑制Akt-mTOR-p70S6K通路相关蛋白位点的磷酸化，从而介导自噬促进PEDV复制。研究DCD对PEDV复制的作用机制，对今后PEDV防治工作有重要参考意义。 相似文献
5.
为探究FILIP1L(filamin A-interacting protein 1-like)蛋白对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响，以Vero细胞中提取的总RNA反转录的cDNA为模板，PCR扩增出FILIP1L基因，克隆到p3×FLAG-CMV-10真核表达载体上。过表达或沉默FILIP1L基因，通过免疫印迹和定量PCR检测FILIP1L蛋白的表达情况，并研究其抗病毒功能。结果：成功构建3×FLAG-CMV-10-FILIP1L重组质粒，转染后能够正常表达。PEDV感染Vero细胞后，FILIP1L基因的mRNA表达显著上调；过表达FILIP1L基因显著抑制PEDV的复制；下调FILIP1L的表达可显著促进PEDV的复制。综上，FILIP1L蛋白能够抑制PEDV在Vero细胞的复制，研究结果为寻找新的抗PEDV药物靶点和研发新型疫苗提供理论依据。 相似文献
6.
【目的】探究单宁酸(tannic acid)对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)复制的影响,为临床治疗PEDV感染提供新的参考依据。【方法】通过检测不同浓度单宁酸对细胞活性的影响,评估单宁酸对Vero和LLC-PK1细胞的毒性;通过实时荧光定量PCR和间接免疫荧光试验检测单宁酸对PEDV YN13毒株复制的影响;将PEDV YN13毒株更换为PEDV DR13-GFP毒株、Vero细胞系换成LLC-PK1细胞系分别进行试验,检测单宁酸对PEDV复制的影响;在病毒感染的不同时间点添加单宁酸,通过实时荧光定量PCR、Western blotting和半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infection dose, TCID50)法检测单宁酸对PEDV复制的影响;通过荧光共振能量转移试验检测单宁酸在细胞外对PEDV 3C样蛋白酶活性的影响。【结果】低浓度的单宁酸对细胞几乎无毒性;单宁酸能够有效抑制PEDV YN13毒株的复制,且单宁酸的浓度越高抑制效果越好;在更换毒株和细胞系后,各浓度单... 相似文献
7.
旨在研究三结构域蛋白5α(tripartite motif protein 5α,TRIM5α)能否通过调控细胞自噬来影响猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea viru, PEDV)在非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)中的复制。利用Western blot(WB)检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达，明确PEDV感染Vero-E6细胞后不同时间点自噬的发生情况。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TRIM5α在自噬模型中的表达水平。设计并合成3条TRIM5α的干扰片段并筛选干扰效率最高的干扰片段，将其转染至Vero-E6细胞，PEDV感染后48 h,通过WB检测LC3Ⅱ蛋白的表达水平；RT-qPCR检测PEDV的N、ORF3基因的表达水平，同时检测PEDV滴度变化，以明确TRIM5α对自噬和PEDV复制的影响。结果表明：PEDV成功感染Vero-E6细胞并诱导细胞自噬。WB结果显示感染24、36和48 h时，试验组的LC3Ⅱ的表达量呈上升趋势，在48 h时表达量最高，且差异极显著(P<0.01),自噬被激活；RT-qPCR结果显示，TRIM5α的表... 相似文献
8.
本试验以猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型细胞,探讨T-2毒素诱导IPEC-J2炎性反应的影响及相关作用机制。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定细胞活力,选择适宜的T-2毒素和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)浓度。试验分为4个组,分别为对照组、NAC组(4.0 mmol/L NAC)、T-2组(4.0 ng/mL T-2毒素)和T-2+NAC组(4.0 ng/mL T-2毒素+4.0 mmol/L NAC),处理12 h后测定各组IPEC-J2中丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性、活性氧(ROS)水平、细胞炎症相关基因和核转录因子-κB(NF-κB)的相对表达量。结果表明:1)与对照组相比,T-2组IPEC-J2中CAT、T-SOD活性极显著降低(P<0.01),IPEC-J2中MDA含量和ROS水平极显著升高(P<0.01)。与T-2组相比,T-2+NAC组IPEC-J2中CAT和T-SOD活性极显著升高(P<0.01),IPEC-J2中MDA含量和ROS水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。2)与对照组相比,T-2组IPEC-J2中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(P<0.05)、白细胞介素-6(IL-6)(P<0.01)、白细胞介素-10(IL-10)(P>0.05)的mRNA相对表达量升高。3)与对照组相比,T-2组IPEC-J2中NF-κB蛋白相对表达量极显著升高(P<0.01)。与T-2组相比,T-2+NAC组IPEC-J2中NF-κB蛋白相对表达量极显著降低(P<0.01)。由此可见,T-2毒素通过诱导IPEC-J2产生过量的ROS,促进炎症相关基因及NF-κB蛋白的表达,导致IPEC-J2发生炎性反应。 相似文献
9.
《动物营养学报》2021,33(7)
本试验旨在评估2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)诱导的氧化应激对猪肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)活力及线粒体功能的影响,以期建立一种稳定的体外研究肠道氧化应激的模型。以不同浓度(0、30、32、34 mmol/L) AAPH处理IPEC-J2细胞24 h后,检测细胞活力、细胞增殖、细胞内总活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位、线粒体DNA(mtDNA)拷贝数以及线粒体功能相关基因[线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体转录因子B1(TFB1M)、线粒体转录因子B2(TFB2M)、解耦连蛋白1(UCP1)、解耦连蛋白2(UCP2)、解耦连蛋白3(UCP3)]表达的变化。结果表明:AAPH对IPEC-J2细胞活力的影响呈剂量及作用时间依赖关系。与0 mmol/L AAPH处理相比,不同浓度(30、32、34 mmol/L) AAPH处理均显著抑制了IPEC-J2细胞增殖(P0.05),细胞活力显著下降(P0.05),细胞内总ROS含量显著升高(P0.05),细胞线粒体功能相关基因(TFAM、TFB1M、TFB2M、UCP1、UCP3)表达显著下调(P0.05),mtDNA拷贝数显著降低(P0.05)。综上所述,AAPH诱导的氧化应激通过增加IPEC-J2细胞内总ROS含量引起细胞线粒体功能损伤,进而导致细胞活力下降,抑制细胞增殖。 相似文献
10.
【目的】探究RNA解旋酶DEAD-box家族蛋白DDX1在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染猪回肠上皮细胞(IPI-2I)期间发挥的作用,为揭示DDX1的生物学功能奠定基础。【方法】参照GenBank中猪源DDX1基因序列(登录号：XM＿021087822.1),设计特异性引物PCR扩增DDX1基因全长并连接至pMD19-T克隆载体,双酶切鉴定成功后连接至pcDNA3.1表达载体;连接产物转化后筛选阳性菌落;培养IPI-2I细胞,取传代2次的细胞铺于6孔板内进行后续试验,将阳性菌落的重组质粒转染至6孔板培养24 h后收集蛋白质,Western blotting检测DDX1转染效率;以感染复数(MOI)为1.0的PEDV感染已转染pcDNA3.1-DDX1或PBS(对照)的IPI-2I细胞,建立PEDV感染细胞模型,PEDV感染12 h后分别收集细胞总蛋白质和RNA;间接免疫荧光试验检测细胞水平上PEDV N蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测PEDV N基因mRNA表达水平,Western blotting检测PEDV N蛋... 相似文献
11.
本试验旨在通过脂多糖(LPS)诱导猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)来建立氧化应激模型,探讨壳寡糖(COS)的抗氧化作用效果。采用噻唑蓝(MTT)法检测LPS和COS对IPEC-J2作用12、24、48 h后细胞增殖活性的变化;选择适宜浓度LPS(1.0μg/m L)和COS(200μg/m L)作用于IPEC-J2,分为对照组、LPS组、COS组、LPS+COS组。采用Western Blot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白的表达;试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)的含量。结果表明:1.0μg/m L的LPS对IPEC-J2作用24 h,细胞增殖的抑制率为41.6%,为造模的最适浓度和作用时间;COS在一定浓度范围内对IPEC-J2有增殖作用,其浓度为200μg/m L时效果最佳,作用时间为24 h时,细胞增殖率达到126.3%。LPS+COS组较对照组的SOD、CAT活性和M DA含量差异不显著(P0.05),Nrf2和HO-1蛋白相对表达量显著升高(P0.05);LPS+COS组较LPS组的Nrf2蛋白相对表达量显著升高(P0.05),HO-1有升高趋势,但差异不显著(P0.05),SOD、CAT活性显著升高(P0.05),M DA含量显著降低(P0.05)。由此可见,LPS诱导IPEC-J2氧化应激,而COS可进一步促进Nrf2和HO-1蛋白的高表达,并提高抗氧化酶的活性,降低氧化产物含量,从而增强细胞对氧化应激的抵抗力,起到保护作用。 相似文献
12.
本试验旨在研究氧化锌与猪肠上皮细胞抗应激和抗炎症能力的关系。试验以体外培养的猪肠上皮细胞系(IPEC-J2细胞系)为模型,考察在有、无脂多糖(LPS)条件下,不同水平氧化锌(0、0.05、0.10 mmol/L和0.15 mmol/L)在不同培养时间0.5、1.5、4.5 h和24 h对细胞HSP70 mR NA表达和IL-10分泌的影响。结果表明:猪肠上皮细胞与氧化锌共培养较长(1.5 h和4.5 h)和长时间(24 h),HSP70 mR NA表达随氧化锌剂量的增加呈线性增加(P<0.01),且高剂量氧化锌(0.10 mmol/L和0.15 mmol/L)显著促进HSP70 mR NA表达(P<0.05),并维持其长期稳定性。高剂量短时间和低剂量长时间的氧化锌处理,显著提高细胞培养液中IL-10水平(P<0.05)。表明高剂量氧化锌可通过促进HSP70基因表达和IL-10分泌,提高猪肠上皮细胞抗应激和抗炎能力。 相似文献
13.
为研究枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是否通过激活猪肠上皮细胞(IPEC-J2)中Toll样受体(TLRs)的表达抑制轮状病毒(RV)的复制,本研究采用RV感染灭活B.subtilis预处理的IPEC-J2细胞,鉴定B.subtilis对RV在细胞中增殖的抑制作用,并检测不同时间点RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞中相关TLRs的表达。结果显示,RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞24 h后,与未处理细胞相比,其病毒的增殖能力显著被抑制。通过荧光定量PCR检测不同处理组细胞TLRs m RNA的表达水平,结果表明RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞在感染早期(1 h和3 h)与其他组相比,TLR2、TLR3、TLR9 m RNA表达均显著增加。本研究表明,灭活的B.subtilis能够抑制RV在IPEC-J2细胞中的增殖,并在病毒感染初期显著提高细胞TLRs m RNA表达,推测可能与调节宿主细胞的先天免疫反应有关。 相似文献
14.
复方术芩提取液体外抗PEDV感染PK-15细胞的作用效果 总被引：1，自引：0，他引：1
为探讨复方术芩提取液体外抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero细胞作用效果,以Vero细胞为宿主细胞,通过检测药物抗PEDV活性,计算其IC50和治疗指数TI,并从药物对PEDV的直接灭活作用、阻滞作用、吸附抑制、穿入抑制及复制抑制5个方面探讨复方术芩抗PEDV作用机理。结果显示复方术芩提取液能明显抑制PEDV的致病变作用,其IC50为17.41mg/L,TI为23.40。各浓度术芩提取液对PEDV病毒复制过程中均有一定的抑制作用,其中直接灭活作用和复制抑制试验效果比较明显,且质量浓度C=100mg/L,与病毒对照相比差异极显著(P<0.01),质量浓度C≥25mg/L,细胞保护率均超过50%。而阻滞试验、吸附抑制试验和穿入抑制试验,药物质量浓度需要达到100mg/L才出现显著的保护作用。表明复方术芩提取液在体外抗PEDV主要是通过对病毒的直接灭活和对病毒复制抑制而达到抗病毒功效。 相似文献
15.
本研究采用荧光定量PCR方法,检测了IPEC-J2细胞不同时间点紧密连接蛋白3(claudin 3,CLDN-3)、细胞角蛋白8(cytokeratin 8,KRT8)、黏蛋白1(mucin 1,MUC1)3种蛋白mRNA的表达量变化。本试验将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染IPEC-J2细胞,探索食淀粉乳杆菌代谢产物是否通过维持或改善CLDN-3、KRT8、MUC1蛋白mRNA表达来增强细胞的屏障功能,是否对IPEC-J2细胞感染TGEV后的屏障功能产生影响。试验结果发现,正常细胞对照组MUC1、CLDN-3及KRT8蛋白mRNA表达量随时间没有显著变化(P> 0.05),MRS培养基对照组与正常细胞对照组相比没有显著变化(P> 0.05),食淀粉乳杆菌代谢产物单独处理组对细胞MUC1、CLDN-3及KRT8蛋白mRNA表达量呈显著上调作用(P< 0.05);食淀粉乳杆菌代谢产物+TGEV试验组与病毒对照组相比,处理24、36和48 h,MUC1、CLDN-3及KRT8蛋白的表达显著升高(P< 0.05)。结果表明,食淀粉乳杆菌代谢产物不仅能提高MUC1、CLDN-3及KRT8在IPEC-J2细胞上的表达,还能负调节TGEV诱导的MUC1、CLDN-3及KRT8在IPEC-J2细胞上的表达,从而加强IPEC-J2细胞对TGEV感染的屏障功能。 相似文献
16.
本试验旨在研究富马酸（FA）与肉桂醛（CA）联用调节产肠毒素型大肠杆菌（ETEC）K88诱导猪肠上皮细胞IPEC-J2氧化应激的分子机制。试验选用IPEC-J2细胞建立氧化损伤模型,用不同浓度FA和CA处理IPEC-J2细胞12和24 h,并用CCK-8法检测细胞活力,确定最佳处理浓度和时间;以最佳处理浓度的FA和CA预处理细胞,ETEC K88感染细胞3、6、12和24 h,检测其活菌黏附率,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子含量和抗氧化指标,并用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定热休克蛋白70(Hsp70)和核因子-κB(NF-κB)信号通路相关基因mRNA相对表达量。结果表明：1) FA和CA的最佳处理浓度分别为1.00 mg/mL和1.00μL/mL,最适培养时间为12 h。2）添加FA和CA可有效抑制ETEC K88黏附IPEC-J2细胞,当ETEC K88感染细胞3 h时其黏附率显著下降（P<0.05）,6、12和24 h时极显著下降（P<0.01）。3）添加FA和CA可极显著降低ETEC K88感染细胞中促炎性细胞因子白细胞介素-8(IL-8... 相似文献
17.
集约化养殖模式造成猪肠道炎症损伤日趋严重,致使小肠上皮屏障功能受损,影响猪群健康度。为研究白屈菜碱(chelidonine)对猪小肠上皮细胞炎症损伤的保护作用,本试验使用H2O2构建猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2 cells)炎症损伤模型,采用MTT法筛选适宜的白屈菜碱浓度,采用ELISA法检测炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β1)以及NO含量,采用qPCR法和Western blot检测上述炎症因子及iNOS的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,在2.5～100.0 mg/L质量浓度范围内,白屈菜碱对IPEC-J2细胞无毒性;2.5、5.0、10.0 mg/L白屈菜碱可显著恢复H2O2诱导的IPEC-J2细胞存活率下降(P<0.05)。经H2O2造模后,NO含量极显著升高(P<0.01)、IL-10含量显著降低(P<0.05)、其余炎症因子含量显著升高(P<0.05),iNOS及上述炎症因... 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2020,(5)
为研究E3泛素连接酶FBXW7与PEDV感染的相互调节作用,本研究采用PEDV感染Vero E6细胞后检测FBXW7蛋白表达水平,结果显示,PEDV感染能够抑制Vero E6细胞中FBXW7的表达水平。将pCAGGS-HAFBXW7转染Vero E6细胞,通过FBXW7过表达试验评价其对PEDV感染复制的影响,western blot检测分析结果显示,过表达FBXW7显著抑制PEDV N蛋白的表达,表明FBXW7对PEDV复制有抑制作用。进一步利用荧光定量PCR检测PEDV感染条件下过表达FBXW7对干扰素及干扰素刺激基因的影响,结果显示,与pCAGGS-HA对照组对比,pCAGGS-HA-FBXW7转染细胞IFN-β、ISG15、 ISG54和ISG56的转录水平均显著提高(p0.05),表明PEDV感染可通过下调FBXW7的表达拮抗宿主天然免疫应答促进其感染复制。本研究阐明了一种PEDV拮抗宿主天然免疫的新策略。 相似文献
19.
赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳糖合成相关基因表达的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在研究赖氨酸(Lys)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳糖合成相关基因表达的影响,深入探讨Lys对乳糖合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个组,每组6个重复,各组细胞培养液中Lys的终浓度分别为0.5(对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0 mmol/L,细胞在37℃、5%CO2条件下培养48 h。结果表明:适宜浓度Lys对乳糖含量和葡萄糖转运载体蛋白1(GLUT1)、已糖激酶Ⅰ(HKⅠ)和已糖激酶Ⅱ(HKⅡ)基因表达量的影响呈显著的剂量依赖关系(P0.05);方差分析结果显示,添加Lys显著或趋于显著影响乳糖含量及乳糖合成相关基因表达。与对照组相比,2.0~16.0 mmol/L组乳糖含量较高(0.05P0.10),4.0~16.0 mmol/L组G LUT1基因表达量显著升高(P0.05),2.0~8.0 mmol/L组α-乳清白蛋白(LALBA)和β-1,4-半乳糖基转移酶-1(β-4GALT1)基因表达量显著升高(P0.05),8.0~16.0 mmol/L组HKⅡ基因表达量显著升高(P0.05);但1.0~2.0 mmol/L组HKⅡ基因表达量显著下降(P0.05),4.0~16.0 mmol/L组HKⅠ基因表达量下降,尤以16.0 mmol/L组显著低于对照组(P0.05)。综上所述,Lys对乳糖含量和GLUT1、HKⅠ和HKⅡ基因表达量的影响存在显著的剂量依赖,Lys浓度为2.0~8.0 mmol/L时,对BMECs内乳糖合成促进效果较好。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2021,(5)
猪流行性腹泻病毒(PEDV)编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞(IECs)cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7(RNF7),将pGBKT7-Nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明Nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-Nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV Nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现Nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。 相似文献