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1.
目的:确定毕赤酵母表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST基因的最佳诱导表达条件。方法:本研究将PCR合成的dybowskin-1ST基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-dybowskin-1ST诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,应用BMMY培养基诱导表达。采用单一变量法及正交试验法,对甲醇诱导的浓度、时间和温度进行了优化,通过SDS-PAGE电泳分析和体外抑菌试验检测目的肽表达丰度。结果:最佳诱导条件:甲醇终浓度为0.5%、诱导时间为72 h、诱导温度为28℃,在此条件下表达产物SDS-PAGE电泳条带灰度值为117,抑菌环直径为28.16mm,可为规模化的抗菌肽表达提供参考数据。 相似文献
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根据已发表的蛔虫抗菌肽cecropin P1基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽下游的SnaBⅠ和NotⅠ位点之间,构建成cecropin P1基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/cecropin P1。载体经SalⅠ酶切线性化,电转化到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中,然后利用以葡萄糖为碳源的培养基（MD）和以甲醇为碳源的培养基（MM）筛选出组氨酸His＋型和甲醇利用正型（Mut＋）酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝cecropin P1基因的重组酵母。经PCR检测证明cecropin P1基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,通过Tricine-SDS-PAGE检测,重组酵母能够分泌表达重组cecropin P1,同时表达的cecropin P1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。 相似文献
3.
重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成.将合成的基因通过SnaB Ⅰ和Not Ⅰ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌表达载体pPIC9K/pBD-2.利用电穿孔法将经Sal Ⅰ线性化的pPIC9K/pBD-2质粒导入毕赤酵母GS115中,通过G418加压筛选得到His+Mut+表型的高拷贝转化子.经PCR检测证明pBD-2基因在毕赤酵母染色体上得到整合.阳性重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,用SDS-PAGE方法在发酵上清中检测到重组pBD-2的存在,说明构建重组酵母菌能够分泌性表达pBD-2.琼脂孔穴扩散法检测结果显示,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性. 相似文献
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依据GenBank猪肠激酶催化亚基(EKL)基因的编码序列设计引物,通过RT-PCR方法从猪小肠黏膜组织中扩增EKL cDNA基因,利用SnaBⅠ和Not Ⅰ酶切位点,将该EKL片段插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒中,并与载体中的α因子信号肽序列融合,构建EKL基因分泌型酵母重组质粒载体pPIC9K/EKL.重组质粒载体经Sal Ⅰ线性化后,以电转化的方法将其转移到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中.然后利用以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选获得高拷贝猪EKL基因的重组酵母.经PCR检测证明EKL基因已整合到毕赤酵母的染色体中.重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE及酶促活性检测,结果显示在酵母菌培养基中检测到相对分子质量为35 000的重组蛋白.经过对制备的胰蛋白酶原进行酶促水解检测,证明该重组蛋白具有激活胰蛋白酶原的活性,表明制备的重组猪EKL具有生物活性. 相似文献
5.
SLC10是以反式剪切引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆到的一个未知基因。将猪囊尾蚴SLC10基因从重组克隆载体pGEM-SLC10扩增并酶切后,与相应酶切处理的毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-SLC10,转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9K—SLC10用内切酶Sac I线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合;采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达;通过SDS-PAGE和Western—blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了表达,但不具有免疫反应性。 相似文献
6.
为获得猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因并研究其抗菌功能,根据CecropinP2成熟肽的编码基因,人工合成3条寡聚核苷酸片段,经PCR获取Cecropin P2基因序列,成功构建了重组表达质粒pPIC9 K-Cecropin P2-His6并转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化子经MD、MM以及G418筛选,1%甲醇诱导表达,利用Tris tricine-SDS-PAGE对表达产物进行检测。体外抑菌试验表明,获得的重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性。本试验为抗菌肽的应用和新抗菌肽类药物的开发提供了必要的试验基础。 相似文献
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抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定 总被引：2，自引：0，他引：2
为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。 相似文献
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为了在毕赤酵母中表达猪髓样分化因子88因子．我们采用RT—PCR从猪肠系膜淋巴结组织中扩增MyD88全基因,并将其克隆到T载体中,测序验证。将目的基因编码序列插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒,并转化毕赤酵母。重组酵母以PCR验证,表达的重组蛋白用HisTrapTMHP柱纯化后用SDS—PAGE进行分析。结果：构建了重组表达质粒pPIC9K—pMyD88,诱导表达蛋白经纯化后SDS—PAGE分析显示,在相对分子质量（M）约34kD处出现1条特异性蛋白带．说明MyD88在毕赤酵母中获得表达。 相似文献
9.
用真核表达引物从pGEM-IL-2重组质粒中扩增出猪IL-2基因，将目的基因和真核表达载体pPIC9K连接转入E．coli的JM109中，得到了猪pPIC9K-IL-2重组表达质粒。通过电激法将经SalⅠ酶切线性化的pPIC9K-IL-2质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中，利用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析，表明在摇床水平及发酵罐中均表达出约17ku大小的分泌性目的蛋白，采用Sephadex G-100分子筛层析对其表达产物进行纯化，纯化结果理想。 相似文献
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应用特异性引物,从鸽新城疫F基因重组质粒pMD-18T-PPMV-1-F中PCR扩增F基因,用EcoRⅠ和NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将F基因定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ和NotⅠ位点,构建重组质粒pPIC9K-PPMV-1-F,对重组质粒鉴定后用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中,影印接种法筛选G418抗性菌株,提取酵母染色体DNA进行PCR鉴定,筛选出鸽新城疫F基因的高拷贝重组菌株。 相似文献