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1.
猪肺炎支原体HN株高密度发酵工艺研究及效力评价 《畜牧与饲料科学》2018,39(11):10-15
旨在建立猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）HN0613株高密度发酵工艺技术。以培养滴度（CCU）作为考查指标，确定Mhp HN0613株的最佳活力代次以及复苏培养时间；通过四因素三水平正交试验筛选最佳基础培养基配方；以通气量、搅拌转速和接种百分比作为单因素考查指标，优化15L发酵工艺参变量，并确定700L高密度发酵放大工艺；按照确定的高密度发酵工艺技术，制备MhpHN0613株灭活疫苗，评价其对兔和仔猪的免疫效力。结果表明，Mhp HN0613株F11代较其他代次CCU水平高，可达1×10^9CCU／mL，为最佳活力代次；其在复苏72h后，pH值降为7．0左右，CCU水平达到最高，为1×10^9CCU／mL，为最佳复苏培养时间；培养体系中，2％的初始葡萄糖添加量、8％接种百分比、初始培养基pH值7．6、15％猪血清添加量为最适培养条件；通气量100L／h、搅拌转速300r／min和8％接种百分比条件最有利于Mhp HN0613株15L发酵培养；首次建立了平衡kLa联动pH值回调的工艺技术路线，并将优化后发酵罐搅拌叶轮结构改为推进式叶轮，降低了叶轮对菌体的剪切作用力，CCU较优化前提高了10倍，且培养周期较优化前缩短了2-3d；700L高密度发酵放大工艺中，Mhp HN0613株培养滴度不低于5×10^9CCU／mL．最高可达1×10^10CCU／mL；免疫兔血清抗体效价均不低于1：40，最高可达1：160；免疫组实验仔猪肺炎减少率均高于80％，临床观察精神及食欲未见异常。该研究为Mhp疫苗规模化发酵生产提供了一定的理论依据。 相似文献
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一株猪肺炎支原体HN0613株的分离鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
采集疑似猪支原体肺炎病理变化的肺脏,经Friis液体、固体培养基培养、纯化,PCR、测序分析、生化鉴定、生长抑制、代谢抑制和致病性试验证实分离获得一株猪肺炎支原体菌株,命名为HN0613.该菌株能适应人工培养基的培养,且传代生长良好,液体培养基中培养达108 CCU/mL;菌株有较强的毒力,可作为疫苗候选株进一步研究.该菌株的分离鉴定为研制猪支原体肺炎灭活疫苗奠定了基础. 相似文献
3.
支原体检验用培养基的研究 总被引：2，自引：2，他引：0
水质和血清对比试验结果表明：以水质电导率低于0．5μs／cm、猪血清总蛋白不低于49g／L、胆固醇不高于1．66mmol／L为标准制备的改良Frey培养基和支原体培养基活菌滴度均达10^9CCU／mL。对滑液支原体GX11-T株及猪鼻支原体BTS-7株1—5代对数生长期培养物检测,均达10^9CCU／mL。改良Frey培养基与支原体培养基经反复冻融8次;或改良Frey培养基经37℃保存24h;支原体培养基37℃保存8h均不影响灵敏度。改良Frey培养基在鸡胚成纤维细胞及鸡胚尿囊液中最小检测量分别为4CCU／mL和2CCU／mL;支原体培养基在BHK：,细胞中最小检测量为8CCU／mL。改良Frey培养基和支原体培养基4℃有效期为1个月,-20℃为12个月。 相似文献
4.
为了筛选免疫原性良好的鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产用菌株，本试验对分离的5株A型、3株B型和3株C型副鸡禽杆菌的致病性和免疫原性进行分析。首先通过毒力试验筛选毒力较强的菌株，对筛选出的菌株进行最小发病剂量测定，再将最小发病剂量定为攻毒剂量，进行免疫原性分析和最小抗原含量测定。毒力试验结果显示，11株分离株均具有较强的毒力，从中筛选出毒力较强的A型菌2株(HN3株和HB2株)、B型菌2株(HN5株和SD4株)和C型菌2株(HN1株和SD3株)。最小发病剂量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株毒力最强，最小发病剂量分别约为2.0×104、1.8×103和2.3×103CFU。免疫原性分析和最小抗原含量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株具有良好的免疫原性，不仅可以抵抗同源菌株的攻击，还能对同血清型异源菌株提供良好的保护，免疫后血清HI抗体效价和阳性比例均较高，且与攻毒保护相关性较好，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分别为5.0×108、1.0×10<... 相似文献
5.
为探索在疫苗研制过程中牛支原体抗原收获时间及抗原定量替代方法,将牛支原体08M株接种于含10%马血清的Thiaucourt's培养基,在110 h内同时监测其颜色变化单位（color change units,CCU）、菌落形成单位（colony forming units,CFU）、菌体蛋白浓度和核酸含量的变化,绘制相应曲线。活菌计数结果（CCU和CFU）显示,牛支原体生长可分为明显的4期,10 h进入对数期,30 h进入稳定期,活菌数最高可达1.0×108 CCU/mL和7.7×107 CFU/mL,75 h进入衰亡期;蛋白浓度从15 h开始迅速增长,至35 h蛋白浓度最高,为72.06 μg/mL,此后维持在58.38~70.65 μg/mL;核酸含量从15 h开始增长,至25 h后Ct值维持在15.32~17.84。结果表明,牛支原体蛋白含量在稳定期初期与活菌数具有良好的相关性。因此,在牛支原体灭活疫苗生产中,稳定期初期是最佳抗原收获时间,可用蛋白浓度法代替活菌计数法进行抗原定量。 相似文献
6.
肺炎支原体的培养和保存条件非常苛刻,是疫苗规模化生产的工艺难题。本文针对猪支原体肺炎活疫苗(168株)生产工艺关键技术进行研究。通过培养试验筛选四种培养基配方表明该疫苗株在低血清改良培养基中生长良好;优化发酵培养工艺,使其在发酵罐培养60～70 h的峰值可达到1010CCU/mL;设计筛选该疫苗耐热保护剂和冻干工艺,37℃下保存10 d的耐老化试验结果显示,下降滴度小于100.5CCU/mL。本研究为提供高效、安全和稳定的猪肺炎支原体疫苗产品奠定基础。 相似文献
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为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加2g/L丙酮酸钠和150mL/L马血清的Thiaucourt肉汤培养基最适宜山羊支原体山羊肺炎亚种的生长,生长滴度可达109 CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养60h后进入稳定期,培养72h时后进入衰亡期。此试验结果为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究提供了参考数据。 相似文献
8.
采用气管结扎、链霉蛋白酶灌注冷消化法分离猪气管上皮细胞,并以对数生长期的猪肺炎支原体(Mhp)感染猪气管上皮细胞,通过间接免疫荧光技术定性定量研究不同滴度的猪肺炎支原体对猪气管上皮细胞的黏附及相同滴度的猪肺炎支原体随时间变化对猪气管上皮细胞的黏附。结果表明,分离的猪气管上皮细胞存活率为95%以上,广谱角蛋白染色阳性;Mhp野毒株XLW-1与猪气管上皮细胞37℃作用30min就能看到少量的支原体黏附,作用4h以上时黏附更明显,并且,二者作用1、2、4、6、10h,XLW-1对猪气管上皮细胞的黏附与阴性对照相比差异极显著(P0.01);1×107、2.5×106 CCU/mL的XLW-1与猪气管上皮细胞37℃作用6h,能看到支原体黏附于细胞表面,并且与阴性对照相比差异极显著(P0.01),而其他低滴度的XLW-1则看不到黏附。 相似文献
9.
研发出一种鸡毒支原体培养基,应用其培养的菌液浓度达到1×10~(11)CCU/mL,远高于目前常用培养基的培养菌液浓度;使用300KD膜包处理15000 mL菌液,按照2次10×浓缩-稀释方法,最终将纯化前蛋白浓度11307.3μg/mL降低到2867.1μg/mL,杂蛋白去除率73.6%;同时将纯化和未纯化菌液制成灭活疫苗免疫SPF鸡,结果未纯化组发生应激反应,而纯化组未见异常,且免疫后3周抗体水平高于未纯化组。本研究解决了鸡毒支原体灭活疫苗制备中培养菌液滴度低,成本高的难题。 相似文献
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试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,重组蛋白P48大小约为66ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平(D450nm值为1.126)。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。 相似文献