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1.
为了研制出能够同时预防猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)感染的二联活疫苗,本研究将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和PEDV中国变异株的纤突蛋白免疫决定簇区域(S1)基因分别克隆至含有PRV胸苷激酶(TK)基因上、下游同源臂的穿梭载体pTK中,构建重组PRV转移质粒pTK-EGFP和pTK-S1。将重组质粒pTK-EGFP与PRV疫苗毒株Bartha-K61基因组DNA共转染Vero细胞,经绿色荧光蚀斑纯化得到重组病毒rPRV-EGFP。随后将重组质粒pTK-S1与rPRV-EGFP基因组DNA共转染Vero细胞,通过反向筛选EGFP阴性蚀斑,蚀斑纯化得到表达PEDV S蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV-S1。本研究将为更有效防控猪伪狂犬病和猪流行性腹泻提供辅助工具。 相似文献
2.
《中国动物传染病学报》2017,(2)
近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。 相似文献
3.
表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒Bartha-K61株TK-突变株的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
提取伪狂犬病毒(PRV)Bartha—K61株基因组DNA为PCR扩增模板，并根据GenBank已发表的PRV Ka—plan株UL区UL25、UL24、UL23、UL22基因序列，选择保守序列设计了两对引物，分别扩增出位于UL23(TK)两侧(含部分TK基因)的可用于同源重组的左臂片段(L)和右臂片段(R)，L包括部分UL25、全部UL24、部分TK，R包括部分TK及部分UL22，L和R的拼接片段中TK基因内部缺失270个核苷酸。将L片段和R片段克隆于pBlueseript M13—载体上，获得pSKLR；再将绿色荧光蛋白载体pEGFP—C1上含GFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插人pSKLR的L片段和R片段之间构成转移载体pSKLRG。提取pSKLRG质粒，经单酶切线性化后用脂质体与PRV Bartha—K61株共转染143TK^-细胞，在细胞培养液中有5—溴脱氧尿嘧啶(BrdU)存在的条件下筛选出表达绿色荧光蛋白的重组PRV Bartha—K61毒株：PRV rBGFP。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2016,(9):1476-1483
参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2020,(2)
根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。 相似文献
6.
《中国动物传染病学报》2015,(4)
本研究运用同源重组的方法,在伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异株PRV JS-2012基础上,构建了一株携带增强型绿色荧光蛋白基因的标记重组伪狂犬病毒,命名为r PRV JS-2012-EGFP。经PCR方法鉴定及荧光显微镜观察分析,结果表明重组病毒构建成功,并能在感染细胞中稳定表达绿色荧光蛋白。生长曲线和空斑试验结果显示,r PRV JS-2012-EGFP与亲本株PRV JS-2012在体外具有相似的生长特性。将r PRV JS-2012-EGFP毒接种14日龄PRV阴性仔猪,能使实验猪100%发病,病死率高达40%,表明r PRV JS-2012-EGFP是一株具有强致病力的标记伪狂犬病毒变异株,在伪狂犬病毒变异株致病机制研究中具有一定的使用价值。 相似文献
7.
《中国兽医学报》2015,(9):1422-1428
为了获得表达猪细小病毒(PPV)VP2蛋白和细胞因子猪白细胞介素-18(IL-18)的重组猪伪狂犬病毒(PRV)。将PPV VP2基因和猪IL-18基因分别插入到PRV转移质粒PG中,得到重组质粒PG18-VP2。利用脂质体转染法将重组转移质粒PG18-VP2与猪PRV弱毒株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,以EGFP荧光标记,通过5轮蚀斑筛选纯化,成功获得表达PPV VP2蛋白和猪IL-18且带EGFP标记的重组伪狂犬病毒IL18-VP2-rPRV。用重组病毒感染ST细胞,12h后在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光;通过RT-PCR证实感染细胞中含有PPV VP2和猪IL-18mRNA;Western-blot试验结果显示,重组病毒能表达具有生物活性的PPV VP2蛋白和猪IL-18。重组病毒经连续20次传代后感染细胞仍能发出绿色荧光,PCR检测表明VP2及IL-18基因在重组病毒中能稳定遗传。为进一步研究表达PPV VP2蛋白和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒的免疫效力奠定了基础。 相似文献
8.
《中国动物传染病学报》2017,(4)
本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术结合同源重组,以伪狂犬病毒经典疫苗株Bartha-K61为骨架,将其gB基因替换为伪狂犬病毒变异株JS-2012的gB基因,经噬斑纯化、PCR筛选鉴定,获得重组病毒r PRV-BJB。体外生物学特性分析结果显示,重组病毒株r PRV-BJB与疫苗株Bartha-K61具有相似的生长特性和噬斑形态,可作为新型重组伪狂犬病病毒疫苗候选株。 相似文献
9.
表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP.通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5.WA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达.该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
10.
为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研... 相似文献