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为研究苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis杀虫晶体蛋白与其受体钙粘蛋白的相互作用,本研究利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)囊膜蛋白GP64细胞膜锚定的特点,将172 bp的N端信号肽(GP64 signal peptide,gp64sp)和135 bp的C端膜锚定区域(GP64 C-terminal transmembrane domain,gp64ctd)连接,并在中间添加了一段含有6个酶切位点的序列,再连接到表达载体pIZ/V5-His,成功构建了一个使外源基因在细胞膜上表达的重组载体pIZ/V5-gp64.将扩增的3 882 bp的棉铃虫钙粘蛋白(Helicoverpa armigera cadherin,HaCAD)基因重复区和近膜区片段与重组载体pIZ/V5-gp64进行酶切和连接,构建重组载体pIZ/V 5-gp64-HaCAD,将其转染棉铃虫细胞系Ha-E-1,通过筛选、细胞克隆和PCR验证,获得了重组钙粘蛋白基因的转基因细胞系Ha-T-CAD.免疫荧光法检测证实,钙粘蛋白在转基因细胞系Ha-T-CAD中成功表达.Western blot检测发现,在Ha-T-CAD细胞的膜蛋白中有140 kD大小的钙粘蛋白.转基因细胞系Ha-T-CAD的构建将为Bt杀虫晶体蛋白作用机理以及昆虫对Bt毒素的抗性机制研究提供基础资料. 相似文献
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对美国白蛾高毒Bt的筛选和杀虫蛋白基因鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
通过生物测定,从山东省不同地区分离和本实验室保存的122株苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(简称Bt)中筛选到16株对美国白蛾Hyphantria cunea具有高毒力的菌株,用SDSPAGE和PCR-RFLP方法对16株Bt的杀虫蛋白和杀虫基因类型进行鉴定.结果表明,有11株Bt菌株中同时含有130 kDa和60或70 kDa的蛋白,1株同时舍有130和140 kDa的蛋白,3株只含有130 kDa的蛋白,1株含有30 kDa的蛋白;有14株Bt同时舍有cryl和cry2类杀虫蛋白基因,其中4株还包括cry9类基因,2株Bt中没有鉴定到已知基因类型,可能含有新的杀虫基因.16株Bt菌株均不舍cry3、cry4、cry8和cry10类基因. 相似文献
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本研究对目前应用最多的两种昆虫细胞BTI-Tn-5B1-4和Sf-9在无血清培养基Sf-900Ⅲ中进行驯化和培养,现已稳定传至45代以上。比较了两种细胞在Sf-900Ⅲ和有血清培养基TNM-FH中的细胞形态、生长速率、病毒产量和重组蛋白表达水平。结果表明,在Sf-900Ⅲ中Sf-9细胞比TNM-FH培养的略大,BTI-Tn-5B1-4的圆形细胞增多,BTI-Tn-5B1-4和Sf-9在Sf-900Ⅲ中生长速度快,群体倍增时间分别为18.5h和21.7h,而在TNM-FH中,BTI-Tn5B1-4和Sf-9的群体倍增时间分别为21.9h和25.4h;在两种培养基中BTI-Tn-5B1-4和Sf-9细胞的病毒感染率、多角体产量和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的表达水平均无明显差异,而碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)在Sf-900Ⅲ中的表达水平明显高于TNM-FH中的水平。 相似文献
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利用粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)围食膜蛋白多克隆抗体,从已构建的华北大黑鳃金龟 Holotrichia oblita 中肠cDNA表达文库中筛选得到1个编码羧酸酯酶的cDNA克隆 HoCL1 ,其开放阅读框(ORF)长1 599 bp,编码532个氨基酸,推导的蛋白质分子质量为59.5 kDa,等电点(p I)为4.5。 HoCL1蛋白具有羧酸酯酶的保守结构域:1个二硫键形成的位点和1个丝氨酸活性中心,三联体催化活性中心位于Ser207、Asp333和His422上,不含有氮联糖基化位点和氧联糖基化位点,只含有3 个半胱氨酸残基。依据氨基酸序列同源性分析和保守结构域分析,HoCL1属于B类酯酶,与赤拟谷盗 Tribolium castaneum 羧酸酯酶相似性最高,为35.2%。通过与其他昆虫羧酸酯酶序列比对及构建系统发育树,发现HoCL1羧基端的氨基酸序列保守性低,但靠近N端的活性中心处的氨基酸序列则高度保守,可与赤拟谷盗、异色瓢虫 Harmonia axyridis 羧酸酯酶聚类在一起。羧酸酯酶 HoCL1 基因的克隆鉴定为进一步研究该基因在华北大黑鳃金龟体内的表达及功能奠定了基础。 相似文献
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采用生物测定法测定了美国白蛾核型多角体病毒(HcNPV)青岛分离株对美国白蛾4龄、5龄和6龄幼虫的杀虫活性。结果表明,HcNPV对4龄、5龄和6龄美国白蛾幼虫的致死中浓度(LC50)分别为1.99×105OBs/ml、1.69×106OBs/ml和8.04×106 OBs/ml;以1.48×107OBs/ml病毒处理时,4龄、5龄和6龄幼虫的致死中时间(LT50)分别为6.14d、8.63d和10.31d,以1.48×108OBs/ml病毒处理时,4龄、5龄和6龄幼虫的LT50分别为5.30d、5.92d和7.12d。在相同病毒浓度下,LT50随着虫龄的增加而增加;4龄美国白蛾幼虫在1.48×106OBs/ml、1.48×107OBs/ml和1.48×108OBs/ml等3个病毒浓度处理下的LT50分别为7.65d、6.14d和5.30d,在相同虫龄条件下,LT50随病毒浓度的增加而降低。以上结果为应用该病毒分离株防治美国白蛾提供理论依据。 相似文献
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采用PCR方法扩增出苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）几丁质酶基因（chiA）编码区1.6kb全长片段,并将该片段分别克隆至原核表达载体pET30a和杆状病毒Bac to Bac表达系统转移载体pFastBac中,分别在大肠杆菌（E. coli）BL21(DE3)和草地贪夜蛾细胞系Sf-9中进行了表达。SDS-PAGE分析表明,在大肠杆菌和昆虫细胞中均有效表达了60kDa的蛋白。将表达产物饲喂5龄棉铃虫幼虫后取其围食膜,扫描电镜结果显示,围食膜结构遭到破坏形成大量孔洞。生物测定结果表明,以上两种表达产物对Bt和NPV均具有增效作用。以AcMNPV ChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与Bt Cry2Ac蛋白混合饲喂棉铃虫幼虫,增效率分别为33.4％和54.5％,其LT50较对照处理分别缩短了17.8h和20.6h;当AcMNPV ChiA在大肠杆菌和细胞系Sf-9中的表达产物分别与甘蓝夜蛾核型多角体病毒（MbNPV）混合处理棉铃虫幼虫时,其LT50与对照比较分别缩短了16.6h和22.4h。 相似文献
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昆虫杆状病毒表达载体系统的研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
杆状病毒表达载体系统是当前基因工程四大表达系统之一,已广泛应用于重组蛋白的合成。文章对杆状病毒表达载体筛选、用于蛋白生产的昆虫细胞培养的研究现状、存在的问题、解决途径和展望进行了较详细的论述。 相似文献
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报道了1株粉纹夜蛾转P35基因工程细胞系,命名为Tn5B-35。苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Au-tographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus,AcMNPV)在该细胞系中连续传代至25代,与原始细胞系Tn5B1-4相比较,其感染率、多角体产量、滴度以及杀虫毒力的变化趋势均比较平稳,并未出现"传代效应"。 相似文献