整合人乳铁蛋白cDNA山羊胎儿成纤维细胞系的建立     

林慧  赵明涛  张玉玲  刘风军  王国华  张涌 《农业生物技术学报》2008,16(3)

通过转基因动物乳腺表达系统生产重组药用蛋白比微生物发酵系统和动物细胞培养系统具有很多优势;同时,体细胞核移植技术为制备动物乳腺生物反应器开辟了一条新的途径。本实验旨在建立稳定整合人乳铁蛋白cDNA的山羊胎儿成纤维细胞系,为体细胞核移植法制备转基因动物提供可靠的供体细胞。本研究采用RT-PCR获得人乳铁蛋白cDNA,通过Long and Acute PCR扩增山羊β-酪蛋白5’ 端6.5 kb的调控序列,以pEGFP-C1为骨架构建乳腺特异性表达载体 p6.5hLF-EGFP。脂质体介导法转染山羊胎儿成纤维细胞,G418抗性筛选3-4周后,经PCR扩增和报告基因EGFP表达检测,得到稳定整合外源基因的转基因供体细胞系,为制备高效表达人乳铁蛋白的转基因山羊乳腺生物反应器提高可靠的核移植供体细胞。  相似文献   

牛皮肤成纤维细胞的分离培养与人溶菌酶基因的转染研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

贾淑玲  刘利杰  彭树英  何玉龙  何小宁  张涌 《农业生物技术学报》2008,16(5)

摘要：为得到转染人溶菌酶基因的核供体细胞,采用组织块贴壁法分离培养牛耳成纤维细胞,经传代纯化培养,绘制生长曲线,将纯化好的带有人溶菌酶和绿色荧光标记基因的载体用脂质体法转入第4代成纤维细胞。24 h后荧光显微镜下检测到有绿色荧光蛋白表达,经500mg/ml G418筛选2周后,G418减半继续培养2～3代 ,PCR检测到有目的条带,说明目的基因已成功导入,因此本研究中获得的转基因牛耳成纤维细胞可能作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究。  相似文献   

猪传染性胃肠炎病毒主要抗原基因S与M双基因共表达载体的构建     

贺小英  彭树英  刘艳春  杨瑞锋  张涌 《中国兽医杂志》2007,43(11):6-9

研究如何提高猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）中主要抗原基因S与M对猪传染性胃肠炎的免疫调节作用,进一步探究基因疫苗的有效开发途径。方法：通过两种方法应用牛β-酪蛋白启动子构建TGEV的S和M融合基因表达载体以及构建IRES连接M和S双顺反子共表达核酸疫苗载体。结果成功构建好M和S融合基因表达载体及IRES连接的M和S双顺反子真核共表达载体,并为利用乳腺生物反应器生产可食性疫苗提供有效措施。  相似文献   

萨能奶山羊β-防御素-3基因的克隆、序列分析及差异表达          下载免费PDF全文

茹坤  苏峰  张一军  刘军  罗艳  徐乔璐  贺晓丽  林小湲  郑月茂  张涌 《西北农业学报》2014,23(7):1-6

β-防御素-3(BD-3)基因在乳腺炎病程中有重要作用,目前尚未见有关山羊BD-3基因的研究报道,根据已发表的牛的BD-3基因序列的编码区(CDS)设计引物,经RT-PCR、连接T载体、挑取克隆和测序,成功克隆出长度为210bp的萨能奶山羊BD-3基因CDS区,并提交至GenBank。分析该CDS区的核苷酸和氨基酸序列,结果表明,所得核苷酸序列与牛、人的序列同源性分别为91.2%和80.9%;其氨基酸序列在萨能奶山羊BD-3蛋白的功能结构域(含23~67个氨基酸)与人的结构域同源性为99.9%,蛋白质三级结构相似。分别用热灭活的金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、大肠杆菌对乳腺上皮细胞刺激0、2、4、6、8h,观察BD-3基因的mRNA水平变化,结果显示,金黄色葡萄球菌刺激4h后,BD-3表达量达到最高,与对照组相比差异极显著(P0.01);停乳链球菌刺激后,BD-3表达量持续升高,8h时与对照组差异极显著(P0.01);大肠杆菌刺激后,BD-3表达量逐渐升高,4h时达到最高,但与对照组差异不显著,之后表达量逐渐下降。成功克隆出山羊BD-3基因,并且在金黄色葡萄球菌、停乳链球菌的刺激下有较高水平的表达,说明BD-3基因在乳腺炎病程中起到重要作用,为乳腺炎的机理研究提供借鉴。  相似文献