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肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长负调控因子,MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷,从而引起动物的双肌性状。本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),并构建可标记表达载体,以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率。利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中,构建pX330-EGFP质粒载体,并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体,以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体;将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞,48 h后提取各组部分细胞基因组,利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2,T9,Q2),其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA;之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组,扩增MSTN基因并进行测序分析,得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40%、40%、60%。本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA,并获得准确的编辑效率,为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴,并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据。 相似文献
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根据GenBank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂α干扰素（IFN-α）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT-PCR扩增水貂α干扰素基因,获得了约564bp片段,将其克隆到pEasy-T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂α干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的水貂的IFN-α基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为94.3%～95.5%,氨基酸序列同源性为89.3%～91.4%。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在78.1%～99.3%之间和69.4%～100.0%之间。 相似文献
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绵羊体细胞核移植融合效率影响因素的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
[目的]提高克隆胚胎融合率.[方法]从受体卵母细胞的细胞松弛素处理组与对照组,供体细胞的梯度差速选择(胰酶浓度0.1;、0.25;,消化时间3 min、1 min)和4组电脉冲融合参数(100 V、120 V、130 V、150 V)等3个环节对绵羊体细胞核移显微操作进行了优化,以重构胚胎的融合率和卵裂率作为检测指标.[结果]未经细胞松弛素的卵母细胞组融合率显著高于试验组(P＜0.05),而胚胎卵裂率差异不显著(P＞0.05);胰酶梯度差速消化供体细胞具有初选作用,各组融合率为71.71;、75.86;、78.75;、75.56;,融合压为130 V时融合率最高.[结论]优化后的程序更适合克隆胚胎的膜融合. 相似文献
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[目的]利用高通量、快速、灵敏的实时荧光定量PCR法,检测转类胰岛素样生长因子1-红色荧光蛋白基因(insulin-like growth factor 1-red fluorescent protein,IGF1-RFP)绵羊中外源基因的拷贝数.[方法]以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为绵羊的内源参照基因,梯度稀释法.[结果]分别获得RFP和GAPDH基因的Q值与起始模板数的相关性标准曲线,R2分别为0.999和0.999,相关性高.通过比较目的基因RFP和GAPDH起始模板数,得到外源基因在转基因绵羊中的拷贝数.编号0152、0216、0217、0218的转基因绵羊拷贝数分别为3、1、1、1.[结论]以IGF-Ⅰ转基因细毛羊为研究对象,针对外源基因序列和内源参照基因序列设计特异性引物,利用实时荧光定量PCR法对IGF-Ⅰ转基因细毛羊外源基因的拷贝数进行检测,并且准确检测外源基因的拷贝数. 相似文献
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研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊（Ovis aries）成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5，FGF5）基因第1外显子以引入终止密码子，获得定点编辑类型的绵羊胚胎，为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA （single guide RNA，sgRNA）寡核苷酸链（sgRNA-T1~sgRNA-T4），构建4组不同的重组表达载体；将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞，随后用CruiserTM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示，sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被CruiserTM酶酶切，且测序结果表明都具有靶向效果，编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中，并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率，结果显示，胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max （ng/μL）∶sgRNA （ng/μL）=100∶50，从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示，引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子，通过在成纤维细胞转染表达载体，成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA （T1、T4）；通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎，成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变，为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。 相似文献
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根据Genβank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂β干扰素（IFN—β）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT—PCR扩增水貂β干扰素基因,获得了约561bp片段,将其克隆到pEasy—T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂β干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的雪貂（EF581890．1）的IFN—β基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为100．0％,氨基酸同源性为100．0％。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在83．0％～100．0％之间和69．4％～100．0％之间。 相似文献
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绵羊PGRMC1蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达 总被引：1，自引：0，他引：1
孕激素受体膜组分1 (progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)是膜相关孕激素受体蛋白家族成员之一,参与哺乳动物颗粒细胞和黄体细胞孕酮的抗凋亡过程,在促进卵母细胞成熟和维持卵巢机能方面具有重要作用.本研究通过RT-PCR对绵羊(Ovisaires)PGRMC1基因进行了克隆和组织表达谱分析,并利用实时荧光定量PCR对该基因在繁殖特性上存在明显差异的两个绵羊品种——多浪羊(常年发情)与中国美利奴羊(季节性繁殖)发情期和乏情期性腺轴组织的表达情况进行了检测.结果获得了绵羊PGRMC1基因部分cDNA序列(GenBank登录号:KM114208),其中编码区(Coding sequence,CDS)全长585 bp,编码194个氨基酸.其编码蛋白中包含一个Cyt-b5保守结构域.该基因在所检测绵羊各组织中广泛表达,其中以卵巢、子宫、肝脏、肾脏和下丘脑组织表达丰度较高.实时荧光定量PCR结果显示,同一绵羊品种发情期子宫、卵巢和松果体PGRMC1 mRNA水平均高于乏情期;不同绵羊品种间性腺轴组织基因表达水平存在一定差异,无论是发情期还是乏情期,多浪羊子宫、卵巢和松果体中PGRMC1 mRNA水平均高于同期的中国美利奴羊.本研究结果表明,PGRM C1在维持绵羊子宫与卵巢机能、调节激素分泌和发情行为等方面可能发挥重要作用.为进一步了解PGRMC1的生物学功能提供一定的理论依据. 相似文献
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肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）可负调控骨骼肌的发育。本研究利用胞嘧啶碱基编辑器（cytidine base editor,CBE）在哈萨克羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子,以期达到敲除MSTN基因的目的。共设计2条靶向哈萨克羊MSTN基因不同外显子的sgRNAs,分别连接至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒,并与pCMV-AncBE4 max-P2A-GFP质粒共转染哈萨克羊胎儿成纤维细胞,经CruiserTM酶酶切检测、Sanger测序和TA克隆分析。结果显示,成功筛选出可以在哈萨克羊MSTN基因外显子提前引入终止密码子的2条sgRNAs,其中STOPsg-1靶位点编辑效率为26.7%,STOPsg-2靶位点的编辑效率为6.7%。本研究成功运用CBE（AncBE4 max）技术在哈萨克羊胎儿成纤维细胞MSTN基因编码区实现定点编辑,为培育精确编辑MSTN基因的哈萨克羊奠定基础。 相似文献
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[目的]研究MicroRNA(miR)483-5p在中国美利奴羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织中的表达变化,以了解其在绵羊胚胎发育中的重要作用.[方法]选择中国美利奴羊胚胎不同发育时期(45、85、115和135 d 4个时期)肾脏和脐带组织为研究材料,采用半定量RT-PCR检测第45d绵羊胚胎不同组织中miR483-5p的表达;同时利用实时荧光定量PCR对miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏和脐带组织的表达变化进行实时检测.[结果]miR-483-5p在所检测的绵羊45 d胚胎各组织中广泛表达,其中以肌肉、心脏和肺脏组织表达丰度最高.实时荧光定量PCR结果显示,不同发育阶段绵羊胚胎肾脏和脐带组织miR -483-5p的表达具有明显的时空选择性.脐带组织miR-483-5p随着胚胎发育其表达量呈逐渐下降的趋势;肾脏组织miR-483-5p则是随着胚胎发育在第85 d其表达量下降到最低,其后在115和135 d其表达量又逐渐上升.不同发育阶段胚胎肾脏、脐带组织miR-483-5p的表达量呈显著性差异(P＜0.05).[结论]miR-483-5p在绵羊胚胎不同发育阶段肾脏或脐带组织中表达明显不同,表明其表达具有选择性;依据miR -483-5p表达的差异性及其涉及的生物学功能,推测miR-483-5p在绵羊脐带和肾脏组织中具有一定的调控作用.研究为进一步了解miR-483-5p在胚胎肾脏和脐带发育中的作用机制提供一定的理论依据. 相似文献