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根据GenBank中发表的西尼罗病毒(WNV)E domainⅢ基因序列设计1对引物,用PCR方法扩增domainⅢ基因片段,回收目的基因片段定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5,构建重组表达载体pMT-DⅢ。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-DⅢ。提取S2-DⅢ细胞的基因组DNA,用PCR方法检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,研究成功构建了重组表达载体pMT-DⅢ,转染细胞经12mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达WNV E do-mainⅢ蛋白的果蝇S2细胞株。 相似文献
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牛白血病是由牛白血病病毒(bovine leukemia virus,BLV)引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。其特征为淋巴样细胞恶性增生,进行性恶病质和发病后的高死亡率。此病早在19世纪末就被发现,但直到1969年才由美国的Miller从病牛外周血液淋巴细胞中分离到病毒。目前此病几乎遍及全世界各养牛国家,亚洲的日本发生也较多。此病在我国于1974年首次发现于上海,目前本病有逐渐扩大蔓延的趋势。在某些牛群中血清阳性率已达30%~50%,已成为牛的重要传染病之一。牛源的血液代用品是生物医学研究的重要方向,具有广阔的应用前景,所以此类代用品病毒安全性检测就日益受到关注。 相似文献
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聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒 总被引:5,自引:0,他引:5
为了建立检测猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法,根据巳发表的PERV的序列,设计并合成了针对PERV核心蛋白(gag)、多聚酶(pol)、囊膜蛋白(env)基因的3对引物,预期扩增片段分别为361、150、265bp。应用PCR技术检测了PERV在4株猪源细胞中的整合情况。结果表明,在所有被检细胞的基因组中均存在有PERV的前病毒序列,应用RT-PCR检测上述4株猪源细胞中PERV特异性MRNA的表达,结果均为阳性。试验还对建立的上述2种方法的特异性进行了探讨,结果表明试验建立的PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究PERV奠定了基础,还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。 相似文献
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[目的]构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5''非编码区(5''UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5''UTR的转录调控规律.[方法]将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达.[结果]缺失R区的5''UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5''UTR启动子活性显著下降.UTR显示出较之LTR强的启动子活性.缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强.[结论]在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性.在5''UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强,同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5''UTR的转录活性. 相似文献
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为了研究鸡B细胞膜免疫球蛋白(mIg)的功能,深入了解鸡免疫系统抗体基因的特点,从鸡法氏囊B细胞cDNA中扩增出Igλ轻链基因,对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析和比较。该基因cDNA全长873bp,编码含226个氨基酸的Igλ轻链,N-端21个氨基酸构成轻链信号肽,随后是2个Ig样结构域。运用融合PCR的方法将该基因与牛IgG Fc受体γRⅡ跨膜区序列嵌合形成重组跨膜分子,构建真核表达载体pcDNA-λR2T,转染COS7细胞,荧光抗体染色及流式细胞术检测到重组鸡Igλ轻链在细胞膜上的表达。所扩增的鸡Igλ轻链基因以及构建表达于细胞膜上的重组鸡Igλ轻链跨膜分子,为研究鸡免疫系统中的抗体轻链基因,探索Igλ轻链和B细胞膜免疫球蛋白的功能奠定技术基础。 相似文献
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减蛋综合征病毒33K蛋白基因克隆及结构分析 总被引:2,自引:0,他引:2
纯化的减蛋综合征病毒(EDSV)DNA经HindⅢ水解、0.8%琼脂糖电泳后,回收各DNA条带并克隆至pBluescriptKS载体,建立了EDSV基因文库,对33K蛋白基因进行了分析。本研究证实,EDSV33K蛋白基因含有2个外显子,与羊腺病毒(OAV)33K蛋白比较,N端编码产物的同源性为30.8%,C端的为60%。用RT-PCR扩增33KmRNA和cDNA克隆及序列分析证实,EDSV33K蛋白含有82碱基(nt)的内含子,去掉内含子33K蛋白基因能形成完整的ORF,其编码产物由177氨基酸(aa)组成,推测分子质量为2.06×104,与人5型腺病毒和OAV的同源性分别为28.1%和44.7%。 相似文献
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蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病.本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BTV荧光定量RT-PCR技术,进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价,并对动物样品进行检验.结果显示,该技术可有效检出不同血清型BTV,与流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)无交叉反应;对RNA标准品的检测灵敏度为102 copies;重复检测CV<5%,可对动物样品进行有效检测.因此,所建立的BTV TaqMan/荧光定量RT-PCR技术可为蓝舌病诊断提供一种快速、可靠的病原检测手段. 相似文献
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中国巴马小型猪封闭群内源性反转录病毒存在状况分析 总被引:4,自引:0,他引:4
检测分析猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus;PERV);PERV)在中国巴马小型猪封闭群中的携带情况.根据本实验室已建立的PCR、RT-PCR检测方法,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(p0l)及囊膜基因(env)的存在与表达进行检测;同时根据目前通用的env基因分型方法检测PERVenv-A、env-B、env-C的存在与表达情况.所有被检样品不仅存在PERV gag、pol、env特异性DNA,而且都能够转录为RNA;所有样品同时存在PERV A、B亚型的前病毒,且有70%个体还同时存在PERV-C亚型前病毒,但仅有90%样品检测到PERV-A亚型的表达,50%检测到PERV-B亚型的表达,而所有的样品均未检测到PERV-C型的表达.巴马小型猪封闭群外周血淋巴细胞基因组中存在PERV-A、B、C 3种亚型,但仅有A、B两种亚型能够表达.PERV-A、B、C 3种亚型的同时存在,预示着巴马小型猪封闭群中存在不同亚型病毒重组的可能性. 相似文献