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本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法.优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×108 CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案.结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×108 CFU/mL的大肠杆菌经90 ℃水浴30 s全部致死后,采用10 μg/mL的 PMA暗孵育15 min后冰上曝光10 min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×108 CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R2=0.9989,最低检测限为103 CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符.该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础. 相似文献
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猪无名高热综合征临床病例研究 总被引:2,自引:2,他引:0
通过电镜直接观察从吉林省、辽宁省部分地区收集到的猪无名高热综合征病料,发现主要为猪繁殖与呼吸综合征病毒、副粘病毒、猪瘟病毒;将从吉林省的无名高热综合征病料中分离到的副粘病毒、病料原液以及由病料制得的自家灭活疫苗分别接种到血清检测无名高热综合征主要病原抗体阴性的健康仔猪,同时设立阴性对照,对临床感染的仔猪进行了病理变化、病毒分离、细菌检测等方面的鉴定分析,对无名高热综合征病原的致病特点、发病规律和灭活疫苗使用中出现的抗体依赖性增强作用(ADE)进行了探讨研究。结果表明:初步认定两省部分地区无名高热综合征的主要病原体为PRRSV,由病料所制得灭活疫苗在活体中具有抗体依赖性增强现象。 相似文献
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克隆拟态弧菌(Vibrio mimicus) OmpK(outer membrane protein K)基因并进行相关序列的分析。根据已发表的拟态弧菌OmpK基因序列设计合成引物,以拟态弧菌CGMCC 1.1969标准株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得801 bp片段并测序,序列已提交至GenBank (GenBank登录号为FJ462707)。拟态弧菌OmpK序列比对结果显示,溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌OmpK基因序列的同源性均大于78%。该基因编码1个含267个氨基酸残基的蛋白质,预测分子质量为29.6 ku。利用基因工程方法将该基因片段定向克隆至表达载体中,并在大肠杆菌中获得高效表达,表达后的OmpK蛋白分子质量约为28 ku。 相似文献
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试验旨在对羊白介素1受体颉颃因子(interleukin-1receptor antagonist,IL-1Ra)基因进行全长cDNA克隆及生物学分析。根据布鲁氏菌感染羊白细胞层SSH cDNA文库中的IL-1Ra基因序列信息及已知核苷酸序列(GenBank登录号:KC425613.1)设计引物,利用RT-PCR结合RACE方法扩增并克隆IL-1Ra基因,对其进行序列及相关分子特性分析。结果表明,羊IL-1Ra基因全长为1 228bp,可编码174个氨基酸,含有1个完整的IL-1保守结构域和1个IL-1Ra结构域(PHA02651结构域)。IL-1Ra分子质量为19 765.8u,等电点(pI)为5.72,其分子式为C_(88)5H_(1385)N_(235)O_(256)S_(11),且含有信号肽。二级结构分析显示,IL-1Ra分子存在较多的β折叠及受体结合位点,与三级结构预测结果一致,且与人/鼠IL-1Ra分子的空间结构相似度极高,达到90%以上。羊IL-1Ra有IL-1特有的三叶草结构,其酶结合结构域位于TYR~(47)至GLU~(66)之间。将羊IL-1Ra与牛、虎鲸、宽吻海豚、猪、家犬、人、鼠等14个物种进行蛋白质同源性比对,发现在各物种间存在5个高度同源的半胱氨酸位点。系统进化树分析发现,羊IL-1Ra基因全长cDNA所编码的氨基酸序列同山羊、牛单独形成一个分支。本研究结果为今后深入研究IL-1Ra基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
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试验旨在通过大肠杆菌表达系统表达鼠源重组CD40L蛋白,探讨其对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)人工完全抗原在免疫BALB/c小鼠过程中的免疫增强作用。用Trizol试剂提取BALB/c小鼠脾脏总RNA并反转录成cDNA,根据CD40L CDS区设计引物,PCR扩增目的基因,构建pGEX4T-1重组载体,进行原核表达,并纯化重组CD40L蛋白;根据曼尼希反应原理,用甲醛法制备TTX免疫原TTX-BSA和检测原TTX-OVA;以人工重组蛋白CD40L佐剂组为试验组,弗氏佐剂组作为对照组,免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法结合SPSS 19.0软件分析各组免疫效果,探讨重组CD40L蛋白在TTX-BSA免疫过程中对免疫效果的影响。结果显示,本试验成功扩增了783 bp的CD40L目的基因,原核表达并纯化了融合GST标签的55 ku鼠源CD40L重组蛋白;与人工制备的TTX-BSA协同免疫小鼠试验结果显示,在免疫初期与弗氏佐剂相比,CD40L具有极显著的免疫增强效果(P0.01)。综上所述,重组蛋白CD40L与TTX-BSA完全抗原协同免疫小鼠,在免疫初期CD40L具有增强机体对半抗原的应答强度的作用,为进一步开发适于小分子半抗原抗体高效制备的免疫增强佐剂奠定基础。 相似文献
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绵羊毛发角蛋白结合蛋白启动子的克隆与活性分析 总被引:2,自引:0,他引:2
以绵羊基因组DNA为模板克隆获得绵羊角蛋白结合蛋白基因KAP6.1启动子。将KAP6.1启动子插入到切除了CMV启动子的pAcGFP1-N1质粒中,构建了重组真核表达载体,并采用脂质体法转染传代培养绵羊皮肤成纤维细胞并检测其表达活性。结果显示:(1)KAP6.1启动子序列大小为830 bp,与GenBank上绵羊角蛋白结合蛋白的参照序列(M95719)有99.64%的同源性;与M95719相比,KAP6.1在349位点、726位点和246位点上分别存在1个C缺失、1个转换(G代替A)和1个颠换(A代替T);在438位点上具有1个依赖DNA的RNA聚合酶结合位点TATA box,但未发现具有依赖DNA的RNA聚合酶识别位点CAAT box;(2)转染24 h后,在蓝光激发下检测到细胞核附近有绿色荧光蛋白的高表达,并在48 h后逐渐减弱,而细胞质内绿色荧光蛋白的表达量增加。这一结果表明,KAP6.1启动子在绵羊皮肤成纤维细胞的表达上可能具有特异性。 相似文献
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利用CRISPR/Cas9系统构建敲除Prdx6基因的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,为探讨Prdx6与布鲁菌感染及胞内寄生的关系构建细胞模型。针对Prdx6基因的第1外显子设计sgRNA,构建重组表达载体Prdx6-pX459-sgRNA,将重组质粒转染RAW264.7细胞,嘌呤霉素初步筛选。单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。结果表明,在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失,导致移码突变。说明成功获得敲除Prdx6基因的RAW264.7细胞系。 相似文献
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为探讨展青霉素(patulin,PAT)不同抗原合成方法对完全抗原制备及抗体产生的影响,本试验利用琥珀酸酐联合活泼酯法,分别制备免疫原PAT-BSA和包被原PAT-OVA。为提高PAT与偶联蛋白的结合率,尝试将BSA修饰为EDA-BSA后与PAT进行偶联,并对比2种偶联方法制备的完全抗原免疫动物后抗血清的效价水平。同时利用琼脂糖凝胶电泳、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶渗透色谱多种方法分析鉴定偶联结果,为PAT单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
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