PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析     

张雪  黄雷  阮进学  刘志国  程英  冯书堂  牟玉莲  李奎 《中国农业科学》2017,50(19):3808-3816

【目的】前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9,PCSK9)基因是人类高胆固醇血症(autosomal dominant hypercholesterolemia,ADH)的主效基因之一,其获得型突变与人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y突变体对低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLR)的降解能力比野生型蛋白强十倍,增加了患高胆固醇血症的风险,从而加速动脉粥样硬化的进程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近,成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病的猪缺乏,且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备PCSK9获得型突变体转基因猪,以模拟动脉血管的病理学变化,加速发病进程,为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【方法】研究使用人PCSK9基因D374Y突变体载体,用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中,并通过体细胞核移植技术获得了人PCSK9基因D374Y突变体转基因猪个体。通过Southern-blot、实时荧光定量PCR、Western-blot等方法,分别从DNA、RNA、蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时,通过组织化学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【结果】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现,至第7天形成较大的单克隆点,且PCR检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段,说明外源片段在基因组中具有完整性;将筛选得到的阳性细胞作为体细胞克隆的供体细胞,通过体细胞核移植技术获得了转基因猪个体。PCR及Southern-blot检测结果显示,D374Y-PCSK9基因可以完整的插入猪的基因组中,且有串联重复现象;RT-PCR和QPCR检测结果表明,人PCSK9基因能在猪肝脏内正常转录且不影响猪内源性PCSK9基因的转录,且在其它内脏器官,如心、脾、肺、肾也能检测人PCSK9基因的表达,而猪内源性PCSK9基因在这些组织中表达量很低;Western-blot检测结果与RNA水平的检测类似。这些结果说明人D374Y-PCSK9基因成功整合到猪基因猪中,且能够正常转录与翻译。通过组织化学染色发现,与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR蛋白水平极显著低于野生型。另外,对克隆猪进行H.E.染色后发现其肝脏组织有明显的病理学变化,该结果说明,LDLR水平的急剧下降有可能是导致肝脏病变的原因。【结论】成功获得了人PCSK9基因D374Y突变体的克隆猪;与野生型猪肝脏相比,克隆猪肝脏中LDLR水平显著降低,并且克隆猪肝脏发生了明显病变。  相似文献   

高校贫困资助问题的现实思考   总被引：1，自引：0，他引：1  

贾可好  李淑贞  刘志国 《山东省农业管理干部学院学报》2009,25(3):179-180

资助和教育是帮助贫困生顺利成长成才的重要保证,二者缺一不可。2007年新的学生资助政策实施后,对贫困生的经济帮扶力度加大,而对他们的思想教育问题却没有得到相应加强,学生资助工作中普遍存在着"重资助轻育人"的现象,以致贫困生存在的一些思想问题得不到有效解决,严重影响了学生资助工作的效果。当前,必须加强贫困生的理想信念教育、自立自强教育、诚实守信教育、感恩回报教育和心理健康教育,以切实提高学生资助工作效果。  相似文献   

枣77个品种果肉愈伤组织诱导培养研究     

赵若雨  郭晓雪  朱文慧  李瑞梅  赵佳雪  杜丹  代丽  刘志国  王立新  刘孟军 《园艺学报》2024,(4):903-914

果肉愈伤组织的大量培养可为悬浮细胞体系的建立、原生质体的分离与培养、遗传转化体系的建立及次生代谢产物的研究提供物质基础。以5个发育阶段的枣果肉为试材,共计77个枣品种,选用10种培养基进行枣果肉愈伤组织诱导研究。结果表明,基因型、果实发育阶段、培养基种类及其植物生长调节剂配比对枣果肉愈伤组织诱导效果均具有显著影响。在启动培养阶段,有42个品种分别筛选出1～6种可诱导出愈伤组织的培养基;有8种培养基可以成功诱导出愈伤组织,其中G1(4.41 g·L^-1 MS+6 g·L^-1琼脂+20 g·L^-1蔗糖+0.5 mg·L^-1 6-BA+2.5 mg·L^-1 2,4-D)和G7(4.41 g·L^-1 MS+6 g·L^-1琼脂+20 g·L^-1蔗糖+0.8 mg·L^-1 6-BA+1.5 mg·L^-1 2,4-D)培养基的适用性最高,达60%,其次为G5(4.41 g·L  相似文献   

养殖环境控制对家禽生产和防病的影响分析     

王锐  刘志国  王斌  孙锡涛  齐轶  章安源 《兽医导刊》2022,(4):168-169

我国家禽饲养量较高,一度位居世界第一,且鸡蛋的产量也一直位居世界第一,但是我国家禽产品的出口量非常低.导致家禽产品出口量低的关键原因在于没有合理控制家禽养殖环境,导致家禽出现各种疫病.家禽养殖环境污染具有影响范围大、作用时间长、治理难度大等特点,会对动物健康产生直接影响,因此本文将综合分析养殖场温热环境、光照与噪声等因...  相似文献   

罗氏沼虾大规格苗种养殖技术   总被引：1，自引：0，他引：1  

董学洪  马建社  刘志国 《水产养殖》2011,32(12):26-29

高邮市是江苏省罗氏沼虾养殖重点,建有国家级罗氏沼虾标准化示范区,产业规模不断壮大,产业链条不断完善,罗氏沼虾已成为高邮市的特色产业、支柱产业,多年来不断探索罗氏沼虾高产高效标准化养殖技术体系,尤其是增温大棚培育大规格苗种（幼虾培育）的技术。2009--2010年借助江苏省水产三项工程项目的支持,  相似文献   

金霉素多克隆抗体的制备与鉴定     

武玉香  刘志国  周志春  杨高山  杜静 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2008,34(2):175-180

    研究制备能有效用于金霉素残留检测的特异性多克隆抗体采用戊二醛法和混合酸酐法合成2种不同的金霉素-BSA完全抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,应用ELISA法鉴定抗金霉素多克隆抗体结果表明,2种血清的抗体效价最高均达32×105,而戊二醛法制备的抗原产生的抗体具有更高的亲和力,抑制率为50%时的金霉素的质量浓度(IC50)为962 μg·mL-1,金霉素的最低检测限为667 ng·mL-1,金霉素和四环素的交叉反应率为77%研究结果为畜产品中四环素类抗生素残留的检测奠定了较好的基础  相似文献   

夏洛来二元杂交羊与小尾寒羊育肥对比试验     

吴和民  王羽  史国太  刘志国  邵梅 《黑龙江动物繁殖》2004,12(1):28-28

2003年公主岭市在开展农区肉羊杂交改良配套技术推广项目中,为了掌握用夏洛来羊做父本二元杂交改良羊生产性能情况,我们于2003年8月1日至11月30日在龙山乡鑫源养羊场进行了育肥对比试验。1试验材料选龙山乡鑫源养羊场自繁的夏×小二元杂交改良当年公羊羔10只为第1组,再选小尾寒  相似文献   

瓯江彩鲤与日本锦鲤及其正反杂交F1形态特征和生长初步研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

刘志国  蔡完其  王成辉 《上海水产大学学报》2003,12(4):289-292

对瓯江彩鲤、日本锦鲤及其正反杂交F1采用同塘试验比较生长率，采用聚类分析和判别分析比较分析形态差异。结果表明，正反杂交F1的瞬时增重率低于双亲，而绝对增重率介于双亲之间；正反杂交F1形态性状有的介于双亲之间，有的表现为超亲本优势，有的性状低于双亲的性状值。总体上，日本锦鲤对正反杂交F1的遗传影响明显大于瓯江彩鲤，2个亲本基因的相互作用在遗传过程中也起到了重要的作用。  相似文献   

CD163双等位基因编辑猪的制备及传代   总被引：1，自引：1，他引：1  

魏迎辉  刘志国  徐奎  Evanna Huyhn  Paul Dyce  李继良  周伟良  董树仁  冯保亮  牟玉莲  Julang Li  李奎 《中国农业科学》2018,51(4):770-777

【目的】猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）,俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高致死性传染病,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV遗传变异性较大,因此国内外并未有理想疫苗能够对此病进行有效防制。Cluster of differentiation 163（CD163）是PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage, PAM）的受体之一,研究旨在利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞核移植技术制备CD163基因编辑的大白猪。【方法】针对猪CD163基因的第7外显子设计构建CRISPR/Cas9基因编辑载体;转染大白猪胎儿成纤维细胞,获得基因编辑阳性细胞克隆;以基因编辑细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎;胚胎移植到受体母猪生产CD163基因编辑猪,并进行后续的扩繁试验。【结果】设计的gRNA能够高效的识别靶位点。对获得的127个细胞单克隆进行PCR和测序显示,共有21个克隆发生突变,其中14个克隆为单等位基因突变或双等位基因杂合突变,7个克隆为双等位基因纯合突变。通过体细胞核移植技术,成功获得了CD163双等位基因编辑的纯合大白猪;并获得首批F₁代CD163基因编辑仔猪,目前健康状态良好。随后将有更多的F₁代CD163基因编辑猪陆续出生。【结论】制备的无抗性筛选标记的CD163双等位基因编辑猪,能够安全并快速地为培育抗PRRSV新品种猪提供育种材料。  相似文献   

环形网在黑鲷与日本对虾混养池中的使用效果     

刘艳春  蒋万钊  石惠丽  刘志国 《渔业现代化》2008,35(4)

为在虾池中混养黑鲷(Sparus macrocephalus),特在虾池中设置环形网.在环形网内养殖黑鲷,并设置集鱼网箱以驱赶的方式将黑鲷集中捕捞;在环形网外边养殖日本对虾(Penaeus japonicus),通过移植藻钩虾(Amphithoe japonica)、拟沼螺(Assiminea sp.)等为对虾提供生物饵料.在2 hm2的虾池中养殖黑鲷产量4 330 kg,捕捞成活率100%,对虾产量为1 100 kg,获利6万余元.  相似文献