SMAD1基因的沉默和过表达及对秦川牛原代成肌细胞生肌的影响     

宁越  米雪  陈星伊  邵建航  昝林森 《中国农业科学》2019,52(10):1818-1829

【目的】为了探索秦川牛（Bos taurus）SMAD1基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为BMP信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论依据。【方法】根据Genbank牛SMAD1（NM_001077107.2）已知序列设计并合成靶向沉默SMAD1基因的干扰序列siSMAD1和阴性对照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌细胞cDNA为模板,利用PCR技术克隆获得SMAD1基因CDS序列,构建腺病毒过表达穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP-bSMAD1。将腺病毒基因组质粒和腺病毒载体穿梭质粒共转染到HEK 293细胞中,通过Cre-loxp重组酶获得重组腺病毒。获得的携带目的基因的腺病毒标记为AD-bSMAD1,重组质粒pDC316-EGFP标记为AD-NC,用做对照组病毒,利用LaSRT法测定腺病毒的滴度。将获得的干扰序列siSMAD1和过表达腺病毒AD-bSMAD1分别侵染秦川牛原代成肌细胞,采用实时荧光定量PCR检测SMAD1基因和成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的mRNA水平,并观察对细胞分化融合情况的影响。【结果】成功获得了1条能有效沉默SMAD1基因siRNA,将其转染秦川牛原代成肌细胞后进行人工诱导分化,相比对照组,SMAD1基因分别下调了75.4%（诱导1d,P<0.01）、66.7%（诱导3d,P<0.01）、60.0%（诱导6d,P<0.01）、54.7%（诱导9d,P<0.01）。此外,还成功构建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒过表达穿梭载体,获得了滴度为1×10 ¹⁰pfu/mL的过表达重组腺病毒AD-bSMAD1。与对照组相比,高滴度过表达病毒AD-bSMAD1侵染秦川牛原代成肌细胞0、1、3、6、9d后,与对照组相比,SMAD1基因的表达水平分别上调了2.10倍（诱导1d）、3.19倍（诱导3d）、105.3倍（诱导3d）,P<0.01）和144倍（诱导9d,P<0.01）;结合肌管形成过程的变化和实时荧光定量结果证明,SMAD1基因促进原代成肌细胞分化和肌管形成,并显著上调成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的表达。 【结论】获得了能有效沉默秦川牛原代成肌细胞SMAD1表达的特异性的干扰序列siSMAD1,以及可成功实现过表达SMAD1基因的腺病毒介导的体外表达载体,可正向调控成肌细胞的分化和肌管形成过程。  相似文献   

人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达     

田媛  王力  龙凤  昝林森  成功 《中国农业科学》2020,53(18):3805-3817

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。  相似文献   

利木赞牛改良陕北本地黄牛效果分析     

昝林森  何凡  郝怀志 《中国牛业科学》2008,34(6)

对榆林市神木县地区和延安地区相同营养水平下的298头利木赞牛改良陕北本地黄牛F1代及陕北本地黄牛的体重和部分体尺指标进行了测定,并进行数据分析。结果表明:利木赞牛与陕北本地黄牛杂交F1代的体高、体长、胸围和髋宽均比陕北本地黄牛有所提高,且差异均达到极显著水平(P<0.01);初生牛的平均体重公牛43.95 kg,母牛41.11 kg,分别比本地黄牛提高126.5%、120.78%,改良效果十分显著。  相似文献   

不同冻精处理方法对牛体外受精胚脸发有的影响     

魏红芳  昝林森  徐照学  辛小玲 《黑龙江畜牧兽医》2008,(10)

试验研究了冻精不同处理方法对胚胎体外发育的影响,现报道如下.  相似文献   

不同冻精处理方法对牛体外受精胚胎发育的影响     

魏红芳  昝林森  徐照学  辛小玲 《黑龙江畜牧兽医》2008,(10)

试验研究了冻精不同处理方法对胚胎体外发育的影响,现报道如下。1材料与方法1．1卵巢的采集黄牛被屠宰后,立即无菌采集其卵巢,刺破特大卵泡,剪掉、多余的脂肪组织,用灭菌吸水纸擦净,投入35～39℃、加有适量青霉素、链霉素的灭菌生理盐水中保存,3h内送回实验室。  相似文献   

利用家畜粪便有氧发酵生产有机肥的研究     

林清  昝林森  辛亚平  田万强 《家畜生态学报》2008,29(1):70-73

畜禽场粪便污染已日益严重,如何利用这些废弃物资源已成为当务之急.本研究以牛粪和鸡粪为主要原料,经过接种EM活性菌在有氧条件下发酵腐熟,以缩短发酵时间为目的,分别对原料的含水量、原料翻堆次数进行了测定,结果表明:原料含水量在60%～65%,翻堆时间以45min/次为宜.发酵的腐熟度指标变化:(1)原料体积和重量减少1/3～1/2;(2)质感松软,颜色为暗棕黑色,无不良气味;(3)微细颗粒小于0.25mm,符合有机肥生产标准;(4)发酵自然温度稳定下降.  相似文献   

韩国的肉牛业     

刘太宇  昝林森 《世界农业》1999,(10):43-44

韩国的本地牛———韩牛,起源于普通牛与瘤牛的杂交种,２０００多年前从中国北方及东北地区引入朝鲜半岛,长期的纯种繁育,主要作为农业生产的工具,由于农业机械的发展,现在的韩牛已为肉用型。由于牛肉的短缺,需要从国外进口牛肉和活牛。由于国民收入的增加,食品结构发生了很大变化,牛肉消费量增加,在国民总收入中农业所占比例下降,而韩国肉牛业所占比例逐年上升。畜牧业占农业的比例从８０年代的７－０％,上升到１９９５年的２２－９％,其中肉牛业占２９－８％。一、韩牛业的变化１－饲养规模韩牛的饲养量从８０年代中期的２５…  相似文献   

当前陕西奶业生产现状、问题及发展趋势与关键技术   总被引：3，自引：0，他引：3  

昝林森 《中国牛业科学》2004,30(1):1-3

本文简述了近几年来陕西奶业的发展现状、存在的问题和向高产、优质、高效、低耗的集约化方向发展的趋势,并指出了今后发展亟待解决的关键技术,对陕西奶业乃至全国奶业的协调发展具有一定的指导意义。  相似文献   

外源性CNT对~3H-赖氨酸在哈白兔体内代谢动力学的影响     

刘登科  昝林森  刘永峰 《核农学报》2007,21(5):518-522

以哈白兔为试验动物,利用同位素示踪法研究外源环核苷酸(CNT)对3H-标记的赖氨酸(3H-Lysine)在动物体内的分布、转运与代谢影响,其示踪动力学可用二室模型来描述:^Y(t)=983.6281e-0.021935t+1773.9999e-0.083932t-983.6281e-0.432590t-0773.9999e-0.050399t+300.2820。研究结果证明,皮下注射95h后,对照组3H-Lysine主要分布于肾脏、心脏、肝脏、脾脏、肌肉中;cGMP组中主要分布分布于膀胱、肌肉、肺脏、肠中;cAMP组主要分布于肌肉、胃、肝脏、心脏、生殖器中;cGMP+cAMP组中主要分布于肌肉、膀胱、生殖器、脂肪。同时,心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌肉、脑、膀胱、肠器官中,皮下注射环核苷酸后均有显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)的变化,说明外源性CNT对赖氨酸在哈白兔血液中的代谢及在组织和器官中分布均有明显影响。  相似文献   

秦川牛SIRT3基因SNPs检测及其与体尺和肉质性状的关联分析     

邓冠群  昝林森  王洪宝 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2016,44(1):1-6，13

【目的】研究秦川牛SIRT3基因的多态性及其对秦川牛体尺、肉用性状的影响,以探索改善秦川牛体尺、肉用性状的分子育种方法。【方法】随机选择相近饲喂条件下468头18~24月龄健康秦川母牛,采用DNA直接测序技术进行SIRT3基因全区域遗传变异检测。运用SPSS16.0软件中最小二乘法拟合线性模型,对SIRT3基因不同基因型与秦川牛体尺(体斜长、体高、腰高、尻长、腰角宽、胸深、胸围和坐骨端宽)和肉质性状(背膘厚、眼肌面积和肌肉脂肪含量)进行关联分析。【结果】经DNA测序发现,秦川牛SIRT3基因在第4内含子上存在2个突变位点,分别为C22522T突变和C22680G突变,均存在3种基因型。χ2检验表明,C22522T和C22680G位点均处于HardyWeinberg极度不平衡状态(P0.01)。关联性分析表明,秦川牛SIRT3基因2个突变位点的不同基因型与体斜长、体高、尻长、腰角宽、胸深、胸围和背膘厚、眼肌面积、肌肉脂肪含量有显著或极显著相关关系。【结论】SIRT3基因对秦川牛部分体尺、肉质性状有显著的影响,可以尝试作为秦川肉牛新品系培育的主要候选基因。  相似文献