Ⅱ型犬腺病毒C株E1、E3区克隆测序及E3区标记载体瞬时表达     

王凤雪  罗国良  柴秀丽  张海玲  易立  邵西群  赵建军  闫喜军 《特产研究》2008,30(3)

设计4对引物，对犬Ⅱ型腺病毒2C（CAV-2C）株E1、E3区进行了扩增，将片段进行T克隆、测序，并构建了E3区缺失、标记EGFP的转移载体，在MDCK和293-T细胞上成功表达，但在MDCK细胞中的转染效率较低。本研究为犬腺病毒活病毒载体构建的研究提供基础。  相似文献   

牛病毒性腹泻病毒Real-timePCR方法的建立及其应用     

张淑琴  谭斌  李鹏  杨勇  孙娜  王凤雪  郭利  温永俊  程世鹏 《特产研究》2014,36(3):1-4

本研究在牛病毒性腹泻病毒5'UTR基因的保守区设计并合成了1对引物,建立了可以定量检测牛病毒性腹泻病毒核酸的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法建立的标准曲线相关系数R2为0.999,扩增效率为95.9%,熔解曲线为单一峰值,可检测到初始模板中4.1×101copies/μL的牛病毒性腹泻病毒核酸,是常规RT-PCR方法敏感性的100倍。该检测方法与猪瘟病毒、传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型病毒等其它牛源病毒均不发生交叉反应;批内与批间重复性试验变异系数均小于2.2%。本试验建立的荧光定量PCR检测方法可用于牛病毒性腹泻病毒的临床诊断。同时,应用本方法对临床病例的各组织器官进行了病毒RNA定量检测结果表明,胸腺等淋巴组织的病毒含量最高,证实病毒主要侵害淋巴器官,此研究可为临床病例的病毒分离提供借鉴。  相似文献   

A型流感病毒及其亚型H5、H7、H9分型RT-PCR检测方法初探     

邵西群  闫喜军  王凤雪  柴秀丽 《特产研究》2008,30(3)

本研究验证了来自资料的A型流感M基因通用引物AIM、通用反转录引物AIU的可用性；参考并分析GENBANK中A型流感的H5、H7、H9亚型病毒序列自行设计H5、H7、H9亚型的分型引物，尝试用RT-PCR方法对A型流感病毒及其H5、H7、H9亚型病毒分型检测，进一步确定3种病毒亚型的诊断流程。  相似文献   

狐狸传染性脑炎中和试验监测方法的建立和应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

柴秀丽  闫喜军  姜莉莉  吴威  丛丽  邵西群  王凤雪 《特产研究》2006,28(4):8-10

本研究建立了狐狸传染性脑炎中和试验方法,采用该方法对疫苗免疫狐狸进行抗体水平动态监测。结果表明:该方法特异性强,重复性好,适用于狐狸传染性脑炎活疫苗免疫效果评价。  相似文献   

CELO病毒fiberl基因部分片段的原核表达及抗原性鉴定     

王凤雪王云峰  智海东王玫 童光志 《中国兽医科技》2005,35(6):468-471

根据鸡胚致死孤儿(CELO)病毒Phelps株的fiberl基因(GenBank序列号u46933)序列设计了1对引物，采用PCR扩增CELO病毒fiberl基因C端(包含Knob—S区)的部分片段，并将其克隆到质粒表达载体pGEX-6P—1，获得的阳性克隆命名为pGEX—AF807。序列分析表明，所获得的DNA片段核苷酸序列与CELO病毒Phelps株的fiberl基因序列完全一致。将pGEX—AF807转化大肠埃希氏菌DH5a，经37C、0．6mmol／L IPTG诱导表达5h，SDS—PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀。结果显示，目的蛋白以包涵体形式存在，蛋白分子质量约为54．6ku，目的蛋白量占菌体总蛋白的35．7％。用CELO病毒多克隆血清做Western blotting试验，结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。  相似文献   

吉林地区高致病性PRRSV JL-04/12株的 分离鉴定与全基因组测序     

王凤雪  郭利  温永俊 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》2013,41(4):37-44

【目的】确定吉林省某疑似高致病性PRRS猪场的病原,研究其基因特性。【方法】采集疑似感染高致病性PRRSV病猪的脏器组织,处理后接种MARC-145细胞,观察细胞病变,分离PRRSV;应用RT-PCR方法检测和确定分离毒株的基因型,采用间接免疫荧光、电镜观察和全基因组测序检测分离的病毒。【结果】分离毒株为北美洲型PRRSV,命名为JL-04/12,其基因组全长为15 320bp(不包括PolyA),可使MARC-145细胞产生典型的细胞病变。序列比对结果表明:JL-04/12株与经典毒株VR-2332和CH-1a的核苷酸同源性分别为89.5%和94.9%;与高致病性毒株JXA1、HUN4的核苷酸同源性为99.1%。分离毒株JL-04/12编码的2个非结构蛋白和GP2～GP4的氨基酸序列与HUN4株同源性较高,在97.2%～99.3%,而JL-04/12编码的GP5的氨基酸序列与JXA1株同源性较高,为98.5%;JL-04/12编码的GP6和N蛋白的氨基酸序列与高致病性PRRSV毒株JXA1和HUN4的同源性均为100%。PRRSV JL-04/12株的Nsp2不连续缺失30个氨基酸,与高致病性PRRSV毒株JXA1和HUN4的同源性最高,均为97.8%,判定该分离株为变异的高致病性PRRSV。【结论】从吉林省分离到1株高致病性PRRSV,说明高致病性PRRS变异病毒在吉林省仍然存在。  相似文献   

3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用     

王凤雪  黄双  刘莹  杨勇  孙娜  朱洪伟  张淑琴  程世鹏  温永俊 《中国畜牧兽医》2015,42(1):24-31

为建立猪细胞因子SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中3种重要的猪细胞因子即猪白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、α-干扰素(interferon α,IFN-α)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因.将3种基因克隆至pMD18-T载体上,得到各自阳性克隆质粒,以3种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验.结果表明,当标准品稀释度为1×10¹~1×10⁶ 拷贝/μL时,3种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均≥0.992.熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好.应用建立的方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM-F92株免疫的30日龄猪外周血单核细胞(PBMC)中IL-12、IFN-α和TNF-α表达量进行检测,结果发现,免疫了PRRSV TJM-F92株的猪PBMC细胞内3种细胞因子表达量均极显著升高(P< 0.01).研究结果为IL-12、IFN-α和TNF-α的定量分析提供了技术平台.  相似文献   

牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL分离株全基因序列测定与分析     

张淑琴  谭斌  王凤雪  程世鹏 《中国畜牧兽医》2014,41(10):23-27

为了解中国农业科学院特产研究所分子生物学重点实验室前期分离的牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL毒株完整的基因序列信息,本试验对BVDV-JL F6代毒株进行了完整基因序列测定。利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分段扩增了BVDV-JL分离毒株的7段cDNA片段,分别克隆于pMD18-T载体并进行测序。BVDV-JL株基因组序列全长为12276 bp,编码3901个氨基酸。基因组两端为非编码区5'UTR和3'UTR。基因比对及进化树分析结果表明BVDV-JL与BVDV CP7同源性最高,核苷酸同源性为93.2%,归类于BVDV-1b2基因亚型。BVDV-JL是第1个在中国报道的BVDV-1b2亚型毒株。了解BVDV-JL完整基因序列有利于中国BVDV流行病学调查。  相似文献   

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染的流行病学调查   总被引：2，自引：0，他引：2  

刘杏  王凤雪  温永俊  武华 《吉林农业大学学报》2016,(4):456-459

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)在我国猪场混合感染的发病情况,根据Gen Bank中PRRSV ORF5及PCV2 ORF1基因序列设计合成引物,建立了分别用于检测PRRSV、PCV2的RT-PCR及PCR方法,对2013—2015年采自吉林、辽宁、黑龙江、山西、山东、广东6省192份样品进行检测。结果发现:PRRSV感染率为22.9%,PCV2感染率为64.3%,28份样品为混合感染阳性,阳性率达14.58%。猪群中PRRSV和PCV2的感染比较普遍,混合感染率也较高,加重了疫病防控的难度。  相似文献   

几种家畜寄生虫基因工程疫苗研究进展     

王凤雪  张凡建 《当代畜牧》2004,(12):33-35

随着集约化养殖业的发展,寄生虫病在畜禽密集养殖条件下显示的危害日趋严重。各种抗寄生虫药物预防虽然带来可观的经济效益,但是药物残留带来的食品与环境问题促使人们将眼光集中于疫苗的研发上面。近年来寄生虫基因工程疫苗的发展亦日益广泛,本文主要对囊虫及绦虫病疫苗、疟原虫疫苗、利氏曼原虫疫苗、隐孢子虫疫苗、弓形虫疫苗和巴贝氏虫疫苗等研究进展作一综述。  相似文献