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1.
2.
核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义. 相似文献
3.
为了检测水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)CP、SP和NSvc4蛋白自身和两两之间的互作关系,首先通过PCR扩增获得了分别融合有HA或c-Myc标签的RSV CP、SP和NSvc4基因,并将其插入到植物表达载体pEGAD或pKYLX71:35S2中。重组质粒转化农杆菌EHA105后,将含有不同重组质粒的农杆菌菌液混合后注射烟草(Nicotiana benthamiana)叶片。提取烟草中瞬时表达的蛋白,以HA抗体或c-Myc抗体进行免疫共沉淀实验,最后免疫混合物通过c-Myc抗体或HA抗体进行Western blot检测,确定蛋白的互作情况。结果表明,RSV CP蛋白自身能够发生互作,而CP与SP,CP与NSvc4,SP与SP,SP与NSvc4,及NSvc4与NSvc4蛋白之间均未有检测到互作现象。 相似文献
4.
在福建蔗区,甘蔗花叶病田间发病率因地区和品种而异。供试9个种及品种对甘蔗花叶病毒株系A的反应为:割手密野生种表现免疫;闽糖70/611和桂糖11表现抗病;福引79/9,F134和闽选703表现中抗;福引79/8表现感病,NCo310和Co740表现高度感病。本文还对田间花叶病的发生特点与品种抗性的关系及品种抗性鉴定的依据和标准等进行讨论。 相似文献
5.
海藻乙醇提取物抗真菌活性 总被引:3,自引:3,他引:3
采用生长速率法和孢子萌发法对福建沿海几种常见海藻的抗真菌活性进行了筛选.结果表明:孔石莼(Ulva pertusa)的乙醇提取物对链格孢菌(Alternaria brassicae),浒苔(Enterom orphasp)、沙菜(Hypneasp)、江蓠(Gracilaria verrucosa)的乙醇提取物对甜椒灰霉菌(Botrytis cinerea)的菌丝生长抑制率都在40%以上;江蓠、沙菜和蜈蚣藻(Grateloupia filicina)的乙醇提取物对香蕉炭疽菌(Gloeosporium musarum)和苹果青霉菌(Penicillium expansum)孢子萌发的抑制率都在90%以上;羊栖菜(Sargassum fusiform e)乙醇提取物对苹果青霉菌的孢子萌发抑制率也在90%以上.化学预试验法结果表明,抗菌活性成分可能为酚类、糖类、内酯或甾醇. 相似文献
6.
水稻条纹病毒云南分离物CP基因克隆及序列比较分析 总被引:3,自引:0,他引:3
对采自云南保山、楚雄、石林和宜良等4地的水稻条纹叶枯病感病稻株,提取病叶总RNA,经RT-PCR扩增,获得4个RSV云南分离物的CP基因片段。序列测定表明,该片段长999 bp,其中CP基因由969个核苷酸组成,编码322个氨基酸。与其它已报道的RSV分离物CP基因进行同源性比较,发现我国RSV分离物可以划分为2个不同的组,大部分RSV云南分离物为一组,其它的RSV 分离物为另一组。以RSV-CXi分离物的CP与纤细病毒属的其它5种病毒的CP进行氨基酸同源性比较,结果表明RSV与MStV亲缘关系最近,而与RGSV亲缘关系最远。 相似文献
7.
水稻条纹叶枯病的研究 Ⅳ.病叶细胞的病理变化 总被引:2,自引:0,他引:2
在水稻条纹叶枯病叶超薄切片的电镜检查中,可见一些叶肉细胞和维管束鞘细胞中叶绿体有不同程度的降解和淀粉粒累积,一些细胞不同程度坏死,叶肉细胞、维管束鞘细胞以及伴胞的细胞质或液泡中有一个或多个蛋白体存在,一些伴胞中有特异性的非外壳蛋白存在,一些细胞中有一些不定形的粒状内含体或砂状结构,而在病株的不同叶位,这种砂状结构数量不同,以+1叶所见最多.研究结果还佐证了前文有关叶绿体中淀粉粒的过量累积可能引起叶绿体的破坏及其后叶片褪绿病斑形成的假说,并推测这可能是同化产物的运输通道受到影响的结果. 相似文献
8.
本文描述了一种简便而有效的克隆基因未知5'和3'末端序列的方法,并用此方法克隆了稻瘟病菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd).即通过比较12种真菌的已知gpd基因序列,寻找内部的保守区段,设计并合成一对特异性引物.引物P1为靠近基因5'端的一个特异性序列,引物P2则与3'端的一段特异性序列互补.以双链cDNA-pBluescriptⅡSK载体连接物为模板,利用基因的特异性引物P1和载体上的标准测序引物T7,PCR扩增出包含cDNA3'末端的序列;利用特异性引物P2和标准测序引物T3,扩增出包含cDNA5'末端的序列.将两片段分别克隆、测序和合并后,得到全长1011bp的稻瘟病菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)的编码区序列.该序列及其相应的氨基酸序列与已知真菌的gpd基因序列有着61.4%-86.6%和64.6%-86.3%的同源性.特别在酶的活性功能区不同真菌间有着近乎相同的氨基酸序列. 相似文献
9.
水稻条纹病毒外壳蛋白和病害特异蛋白在寄主体内的积累 总被引:13,自引:0,他引:13
PAS ELISA检测结果表明:(1)水稻条纹病毒外壳蛋白和病害特异蛋白在水稻寄主体内累积量的变化趋势是一致的,而且均与寄主症状的严重度密切相关.(2)不同水稻品种中,2种蛋白的累积量和累积速率有明显差异.明恢63(高感)2种蛋白的累积量均比IR36(高抗)的明显大;06381(耐受性低)2种蛋白的累积速率均比岗优22(耐受性高)的明显快,06381病叶中2种蛋白累积量在其显症30d左右达到高峰,而岗优22的则在40d左右 相似文献
10.