从全长cDNA克隆恢复猪瘟病毒方法的研究     

范运峰  赵启祖  赵耘  邹兴启  张仲秋  王琴  宁宜宝 《中国畜牧兽医》2009,36(6):56-60

以携带猪瘟病毒Thiverval株全长cDNA克隆的pAC/F101/T1-7载体质粒为模板,在体外转录病毒基因组RNA,并转染PK-15和BHK-21细胞,通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,成功地在两种细胞中拯救出具有感染性的病毒粒子。同时,通过2种细胞转染效率的对比试验,成功建立了利用高转染效率的其它真核细胞作为病毒拯救的过渡细胞,然后再在猪肾细胞系上进行增殖的病毒拯救方式,极大提高了猪瘟病毒拯救的效率。  相似文献   

猪瘟流行野毒E~(rns)基因的序列分析     

刘湘涛  韩雪清  刘伯华  赵启祖  李明晖  马军武  李建强  谢庆阁 《中国农业科学》2000,33(4):75-81

 利用反转录 ( RT)和 PCR技术完成了 5株近期 ( 1 997～ 1 998年 )猪瘟流行毒和 1株猪瘟 C-株弱毒疫苗毒 (兰州 ) Erns(或称 E0 )基因的核酸序列测定。通过序列分析发现 ,这 5株流行毒与 C-株疫苗毒的核酸序列同源性为 83%～ 84%;推导的氨基酸序列同源性为 88%～ 91 %,我国 50～ 60年代流行的中国石门株 ( SM)的核酸序列同源性为 85%;氨基酸序列同源性为 89%～ 91 %。而 5株流行毒间的核酸序列同源性为 91 %～ 98%;氨基酸序列同源性为 94%～ 98%。  相似文献   

转移抗猪瘟病毒核酶基因兔的研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

王敏华  王斌  江金益  范必勤  赵启祖  谢庆阁  龚晓明  杜念兴 《畜牧兽医学报》1996,(4)

采用显微注射法，将构建的绵羊金属疏因（ｏＭＴ）基因启动子与抗猪瘟病毒核酶（ＨＣＶ－Ｒｉｂｏｚｙｍｅ．ＨＲ）基因融合的质粒ｐＭＨＲ＿（３２）线性ＤＮＡ分子约２００～４００个基因拷贝导入兔原核胚的雄原核中，１５９枚导入基因胚移植给９只受体兔，产仔２２只，移植成活率为１３．８％。２２只仔兔经聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和核酸探针杂交检测，６只体内整合有外源目的基因，整合率为２７．３％。再用１００个半数反应量（ＲＩＤ＿（５０））的猪瘟病毒Ｃ系兔化弱毒兔体攻毒，４只外源基因整合的实验兔能完全或部分抵抗ＨＣＶ弱毒攻击，不产生或无明显发热反应；而对照兔和６只ＨＲ基因未整合的实验兔不能抵抗ＨＣＶ弱毒攻击，出现特征性的稽留热型。逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和ＲＮＡ探针杂交检测４只转基因兔，两只肝中表达出ｏＭＴ－ＨＲｍＲＮＡ。认为微注射导入的外源ＨＲ基因在兔体内得到了整合和表达  相似文献   

猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒系统中的表达及纯化     

牛康  徐璐  张乾义  夏应菊  朱元源  邹兴启  李翠  赵启祖  王琴 《中国兽医杂志》2019,(2):31-35,38,I0004

采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。  相似文献   

猪瘟抗体镧系荧光免疫层析法的建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

王泽洲  王琴  赵启祖  吴俊清  章健  吴冠英 《四川畜牧兽医》2018,(6)

本研究以纯化的猪瘟病毒(CSFV)重组E2蛋白和纯化全病毒为抗原,用镧系元素铕(Eu)为荧光标记,建立了猪瘟抗体镧系荧光免疫层析快检法,经特异性、敏感性、重复性试验,表明该方法具有敏感性和特异性强、重复性好、快速、无辐射、高通量等优点,且操作简单、省时省力,该方法完全可以用于CSF抗体检测和免疫效价评估。  相似文献   

CRISPR/Cas9基因编辑技术在重要猪病毒病防控中的研究与应用     

戴学宇  张乾义  徐璐  赵启祖  王琴  夏应菊 《畜牧兽医学报》2020,51(5):943-951

规律成簇的间隔短回文重复序列系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）是一种广泛存在于古细菌和细菌中，由RNA介导在Cas蛋白协助下发挥作用的获得性免疫系统，目前，已发现的CRISPR系统中以CRISPR/Cas9应用最为广泛，本文主要对CRISPR/Cas9系统的基本原理和研究进展进行概述，着重介绍其在重要猪病毒病防控中的应用，包括改造宿主和改造病毒两方面，该技术为研究病毒致病机制、新型疫苗研发以及抗病育种研究等提供了强有力的工具，对疫病的控制有着深远的影响。  相似文献   

猪链球菌2型的鉴定及其毒力因子检测   总被引：1，自引：0，他引：1  

杨承槐  宁宜宝  赵启祖  宋立 《中国兽医学报》2009,29(3)

猪链球菌的感染不仅对养猪业造成巨大的损失,同时对公共卫生尤其是相关从业人员的生命造成威胁,严重感染引起死亡.根据参考文献,设计了1对猪链球菌2型特异性引物.对四川分离的7株链球菌、江苏分离的1株、北京分离的6株和菌种中心保存的5株C群马链球菌兽疫亚种、1株D群链球菌、4株R型链球菌、2株S群链球菌和E、F、G、K、L、M、N、O、P群链球菌各1株进行了检测.结果7株四川分离株均为2型;1株江苏分离株为2型;6株北京分离株有3株为2型;1株R群、2株s群链球菌为2型猪链球菌.对检测出的14株猪链球菌2型的毒力因子做进一步检测.MRP基因检出率为92.9%(13/14);EF基因检出率为100%(14/14);sly基因检出率为71.4%(10/14);Cps2A基因检出率为92.9%(13/14);gapdh基因检出率为64.3%(9/14);FBPS基因检出率为92.9%(13/14);orf2基因检出率为71.4%(10/14).毒力因子全为阳性的菌株有6株,MRP-EF+菌株有2株.本研究从259份健康猪扁桃体中分离到16株2型猪链球菌,健康猪带菌率为6.2%(16/259).16株猪链球菌2型中,MRP、EF、Cps2A全为阴性,只从1株2型猪链球菌中检测到了sly基因(1/16);gapdh基因检出率为56.25%(9/16);FBPS基因检出率为75.0%(12/16);Orf2基因检出率为37.5%(6/16).  相似文献   

猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的研制和应用     

徐璐  范学政  徐和敏  赵启祖  邹兴启  朱元源  王琴  宁宜宝  沈青春 《中国兽医杂志》2012,48(9):21-24,97

对猪瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的稳定性及保存条件等进行了摸索,确定该试剂盒具有良好的稳定性,并可在2℃～8℃环境中的保存9个月。同时,测定了本试剂盒与荧光抗体病毒中和试验的符合率为92.62%;并将该试剂盒应用于免疫动物抗体的动态监测。  相似文献   

猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救   总被引：3，自引：0，他引：3  

范运峰  赵启祖  赵耘  邹兴启  徐璐  张仲秋  王琴  宁宜宝 《畜牧兽医学报》2009,40(9)

采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具.  相似文献   

猪瘟病毒Thiverval株3'非编码区插入片段对病毒拯救的影响     

范运峰  赵启祖  赵耘  邹兴启  张仲秋  王琴  宁宜宝 《中国预防兽医学报》2009,31(6)

猪瘟病毒(CSFV)疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3'-UTR含有一定长度的插入序列.本研究通过反向遗传学操作,构建了3'-UTR含有19 nt、32 nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3'-UTR插入片段并不影响病毒的拯救.通过3'-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3'-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一.  相似文献