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以甘蓝‘E1’为材料,采用PCR和RT-PCR技术,扩增SRK激酶结构域(记为SRKE1)编码区DNA和cDNA序列,得到片段长度分别为1711bp和1241bp,序列分析表明该序列由五个内含子和六个外显子组成,编码407个氨基酸;构建了SRKE1原核表达质粒pET43.1-SRKE1和真核表达质粒pPIC9K-SRKE1,分别在表达宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。用我们表达的THL1与SRKE1孵育,结果显示SRKE1可与THL1结合并形成稳定的复合体。 相似文献
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结合《园艺植物育种学》教学实践和教学改革中的体会,总结指出通过以下几个方面改革能够有效地提高教学质量:(1)注重主讲教师选拔,构建合理教学团队;(2)完善课程体系,优化教学内容;(3)改进教学手段,完善教学方法;(4)重视实验教学,提高学生综合能力;(5)加强强网络课件建设,拓宽学生学习渠道。 相似文献
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通过双向电泳结合MALDI-TOF-TOF/MS 质谱技术在甘蓝柱头内鉴定出1 个受自花授粉诱导
上调表达的BYPASS1 蛋白(BPS1)。利用PCR 技术扩增甘蓝BPS1 基因的编码序列, 序列分析结果表明:
该基因没有内含子,开放阅读框为1 059 bp,编码352 个氨基酸,蛋白质分子量为38.7 kD。氨基酸同源
性和系统发生树分析结果表明:甘蓝BPS1 与拟南芥BPS1 亲缘最近,氨基酸同源相似性达85%;与烟草
BPS2 关系较远。RT-PCR 检测结果表明:甘蓝BPS1 基因在开花前1~2 d 的花瓣、萼片、花药、柱头和
叶片中均有表达,柱头中的表达量最高。实时荧光 定量PCR 分析结果表明:甘蓝柱头内BPS1 表达水平在
自花授粉后逐渐升高,异花授粉后柱头内BPS1 表达水平先升高后降低再升高。 相似文献
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通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉1 h 和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比,鉴定出1 个受
自花授粉诱导上调表达的蛋白,通过PCR 技术获取了其编码序列,命名为BosiPA1 蛋白,其基因全长为
3 730 bp,具有1 个1 092 bp 的完整编码框(KF314579)。BosiPA1 由6 个外显子、5 个内含子组成,编码
363 个氨基酸。序列分析表明BosiPA1 蛋白具有典型的basic helix-loop-helix(bHLH)功能域,在SCR、SRK、
Exo70A1 基因的ATG 上游启动子序列中存在可以被bHLH 功能区识别并结合的E-box(CANNTG)序列。
在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128 距离最近,与AtHEC1/2/3 和TgGBOF-1 处在同一个分支。RT-PCR
检测表明甘蓝BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达;荧光定量PCR 分析表明BosiPA1
基因在自花授粉10 min、30 min、1 h 的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明BosiPA1 与bHLH 的进化
分支较早,可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。 相似文献
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SRK与SCR是甘蓝自交不亲和雌雄性决定因子,两者间相互作具有单倍型特异性。为了探讨HVI/II区域在SRK单倍型特异性及其与SCR互作中的作用,采用重组技术构建甘蓝不同单倍型eSRK (SRKE与SRKF)间的重组体eSRKE-1、eSRKE-2和eSRKE-3,用酵母双杂交系统3检测各eSRK重组体与SCR之间的相互作用。结果表明: (1) SCRE能与eSRKE作用,而不能与eSRKF作用,说明eSRKE、eSRKF属于不同单倍型;(2) SCRE与重组体eSRKE-1、eSRKE-2、eSRKE-3均不发生作用,HVI和HVII区域内差异的氨基酸位点共同参与了与SCR的作用;(3) SCRF不能与eSRKE-1、eSRKE-2、eSRKE-3作用,替换HVI/II区域后并不能改变SRK的单倍型。 相似文献
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利用酵母双杂交系统鉴定甘蓝SCR与SRK胞外域片段间的相互作用 总被引:1,自引:1,他引:0
[目的]利用酵母双杂交系统鉴定甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域(eSRK)片段间可能的相互作用区域.[方法]以结球甘蓝B3为材料,利用分子克隆技术,分别构建以pGBKT7为载体的全长SCRB3、SCRB3-1、SCRB3-2的重组诱饵质粒;以pGADT7为载体的全长eSRKB3、eSRKB3-1、eSRKB3-2的重组激活域(AD)质粒.用PEG/LiAc法将上述重组诱饵质粒转化感受态酵母菌Y2HGold,重组AD质粒转化感受态酵母菌Y187;Y2HGold[pGBKT7-SCRB3-s]、Y187[pGADT7-eSRKB3-s]两两融合培养,观察交配菌在SD/-Trp-Leu/x-α-ga1/AbA(DDO/x/A)、SD/-Trp-Leu-Ade-His/x-α-gal/AbA(QDO/x/A)平板上的生长情况.[结果]酵母双杂交重组表达载体构建成功,且无毒性和自激活作用产生;9个试验组中只有SCRb3-1、SCRb3-2与eSRKBb3-1、eSRKb3-2重组表达质粒转化子两两组合的4个融合株在QDO/x/A平板上出现蓝色克隆,激活了报告基因AUR1-C MEL1、HIS3、ADE2.[结论]酵母双杂交系统适用于SCR与SRK蛋白相互作用的研究,初步确定了SCR与eSRK存在相互作用,SRK跨膜域的存在与否对其相互作用的研究没有影响. 相似文献
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bHLH类转录因子在植物叶片形态建成和发育过程中发挥重要的生理功能。本文通过结球甘蓝转录组数据分析,筛选出莲座期和结球期的茎尖间与叶片间均显著差异表达的2个bHLH类转录因子,命名为BoLH01和BoLH02基因,获得了2个基因的编码序列,其中BoLH01基因CDS全长为966 bp、编码321个氨基酸;BoLH02基因CDS全长870 bp、编码289个氨基酸;序列分析表明BoLH01和BoLH02分别与拟南芥AtbHLH18和AtbHLH19氨基酸同源相似性最高,达81%和74%,均具典型bHLH结构域特点和完全保守的13E-16R和9H-13E-17R以及Leu23对应的关键氨基酸位点;分子进化上BoLH01、BoLH02与AtTCP2/3/4/10/24亲缘关系较近,与AtTCP9/11/14/15较远;转录组和荧光定量PCR分析表明BoLH01和BoLH02在平展的莲座叶中表达量较低,在卷曲的球叶中高量表达;序列分析BoHB7、BoHB12和BoILL6的ATG上游均包含能被bHLH功能域识别的E-box序列,对BoHB7、BoHB12和BoILL6荧光定量PCR分析表明, 三者与BoLH01和BoLH02在不同时期叶片中表达量的变化趋势完全一致;说明BoLH01和BoLH02可能通过正向调控BoHB7、BoHB12、BoILL6基因的表达来参与甘蓝叶片卷曲的调控。 相似文献
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结球甘蓝SRK-ARC1-Exo70A1互作域的确定及作用强度 总被引:1,自引:1,他引:0
【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域,根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝E1为材料分别扩增SRK、ARC1和Exo70A1含不同功能域的截短体片段,利用分子克隆技术将SRK激酶域(SRKj)及其截短体SRKjΔ1-SRKjΔ4,Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1-Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至pGADT7(AD)质粒,将ARC1及其截短体ARC1Δ1-ARC1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体pGBKT7(BD)质粒。用PEG/LiAc法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/ X-a-gal/25 mM 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步测定其β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和内切酶分析显示成功构建18个酵母双杂交表达载体,且无自激活能力。在SRK-ARC1的10个试验组合中,只有ARC1Δ4、ARC1Δ8、ARC1与SRKj组合的融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-a-gal/25 mM 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着SRKj或ARC1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,其中,ARC1Δ4与SRKj组合的β-半乳糖苷酶活性最高(酶活为15.98)。在ARC1-Exo70A1 16个试验组合中,Exo70A1Δ3与ARC1Δ1Δ3都相互作用,其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-a-gal/25 mM 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着ARC1或Exo70A1 截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性呈现先增加后降低的趋势,其中ARC1Δ2与Exo70A1Δ3组合的β-半乳糖苷酶活性最大(酶活性为25.07)。说明ARC1的N端和 Exo70A1的N端发生了互作,而ARC1的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测蛋白相互作用发现,SRKj与ARC1Δ4、ARC1Δ2与Exo70A1Δ3均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域(SRKj)与ARC1的C端臂重复区发生互作,缩短SRK激酶域中的任何结构域或者缩短ARC1的臂重复区,二者都不会发生互作。ARC1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70A1的N端结构域(去除pfamExo70A1域)介导了二者的相互作用。SRK-ARC1的作用力强度小于ARC1-Exo70A1的作用力强度。 相似文献
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以结球甘蓝(Brassica oleracea L.)‘519’品系为试材,通过结球期茎尖和叶片以及莲座期
茎尖和叶片的转录组对比分析,筛选出4 个显著差异表达HB 类基因,分别为BoHAT2、BoHB12、BoHB7
和BoHB27。进一步对上述4 个基因以及调控拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片卷曲但在结球甘蓝转录
组中未检测到表达差异的基因BoPHB、BoPHV 和BoREV 进行了同源克隆。序列分析表明上述7 个基因
都含有同源异型域(homeodomain,HD),具有同源异型盒(homeobox,HB)蛋白家族的典型结构特征。
BlastP(蛋白序列与蛋白库做比对)表明它们与拟南芥的同源蛋白相似性高,来自结球甘蓝的BoHAT2、
BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoPHB、BoPHV、BoREV 与拟南芥中的HAT2、ATHB12 、ATHB 7、ATHB27、
PHB、PHV、REV 蛋白同源,同源性分别为86%、80%、79%、60%、94%、95%和96%。BlastP 比对和
进化树分析结果表明,BoHAT2 属于HD-ZipⅡ类,BoHB12 和BoHB7 属于HD-ZipⅠ类,BoHB27 属于
ZF-HD,BoPHB、BoPHV 和BoREV 属于HD-Zip Ⅲ类。BoHAT2、BoHB12、BoHB7、BoHB27、BoPHB、
BoPHV、BoREV 在结球甘蓝莲座期到结球期的茎尖和叶片中均有表达,BoHB12 和BoHB7 在结球期叶片
中表达量显著增高,分别是莲座期叶片的38.1 倍和6.2 倍,其余基因表达量差异不明显,表明BoHB12 和
BoHB7 可能是结球甘蓝球叶自然卷曲过程中的主效调控基因。 相似文献