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利用Cytodex 3微载体悬浮培养系统规模化培养大鲵肌肉细胞(GSM)和大鲵虹彩病毒(GSIV),研究了微载体培养GSM细胞的形态和增殖特性,同时测定了病毒在培养系统中的增殖动态相关指标。结果显示,在Cytodex 3微载体培养系统中,将GSM细胞在贴壁期以转速30 r/min,每静置40 min搅拌2 min的方式间歇搅拌,10 h后贴壁率可达95%,培养基中最适血清浓度为10%,最适微载体浓度为2 g/L,最适细胞初始接种密度为1.2×10~5 cells/mL;增殖期以25 r/min的连续搅拌方式可以达到最佳的细胞生长效能。倒置显微镜与扫描电镜观察结果显示,GSM细胞呈长梭形,紧密贴附在Cytodex 3微载体上,生长良好。采用优化的工艺条件培养GSM细胞,以感染复数(MOI)为0.5的剂量接种GSIV至规模化培养的GSM细胞,48 h后GSM细胞出现典型的细胞病变效应,72 h病毒滴度达到最高TCID_(50)=10~(–8.50±0.20)/mL。本研究为大鲵虹彩病毒病疫苗的规模化生产工艺研究奠定了前期基础。 相似文献
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本文研究了在Cephodex微载体悬浮培养系统中规模化培养鲫脑组织细胞(Gi CB)和鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ,CyHV-2)的工艺。结果表明,Cephodex微载体适合GiCB细胞的贴壁培养,细胞贴壁期培养基中血清浓度为10%,微载体浓度为6 g/L;细胞初始接种密度为2.5×10~5cells/m L时,以转速35 r/min,每静置30 min搅拌2 min的间歇搅拌条件贴壁率最佳,8 h后贴壁率可达90%以上;增殖期以45 r/min的连续搅拌速度可获得最佳的细胞生长效能。采用优化的工艺条件,以感染复数为0.2的CyHV-2病毒接种规模化培养的GiCB细胞5 d后,出现典型的细胞病变效应,病毒滴度(TCID_(50)/m L)可达10~(6.50±0.30)。本项研究为鲫造血器官坏死症疫苗的规模化制备技术研究奠定了前期基础。 相似文献
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鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生 总被引：2，自引：2，他引：0
为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对Cy HV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(Gi CB),对Cy HV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对Cy HV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中Cy HV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,Cy HV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对Cy HV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代Cy HV-2细胞培养物,结果均为阴性;Cy HV-2在Gi CB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.52±0.26 TCID50/m L),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,Cy HV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。 相似文献
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草鱼天然抗性相关巨噬蛋白基因全长cDNA的克隆与表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
天然抗性相关巨噬蛋白(Nramp)家族是一类抑制胞内寄生菌侵染的天然免疫相关蛋白.本研究克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Nramp基因并进行了表达分析.该基因cDNA序列全长为3158 bp,编码1个含544个氨基酸的蛋白.该蛋白含有Nramp家族的特征序列:包含12个跨膜区(TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运结构域(CTM).草鱼Nramp同其他16个物种的Nramp氨基酸序列同源性在62.5%～90.2%之间.草鱼Nramp基因cDNA的独特结构是其3味端非翻译区(UTR)和5'UTR各有1个脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(IRE).系统进化分析表明,草鱼Nramp和所有鱼类Nramp聚为一簇,与哺乳类Nramp2的亲缘关系较近.Nramp基因在单鱼头肾和脾脏中的表达量最高,在肌肉和皮肤中的表达量最低,在草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染的草鱼肾脏细胞系(CIK)中的表达量明显升高. 相似文献
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为深入研究鲤疱疹病毒Ⅱ型CyHV-2与宿主细胞相互作用机制,以鲫脑组织细胞系(Gibel carp brain,GiCB)总RNA为模板,反转录合成cDNA,扩增获得双链cDNA,与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187,构建了GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库。以CyHV-2 ORF25编码蛋白为诱饵,与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交,筛选与其互作的GiCB细胞受体。结果显示:GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库转化效率为1.03×10~6 CFU/μg,滴度为1.24×10~6 CFU/mL,PCR扩增结果表明文库中插入片段的大小在1.5 kb左右。将表达CyHV-2 ORF25编码蛋白的诱饵菌与GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库杂交后,筛选得到与ORF25编码蛋白相互作用蛋白的阳性克隆,为进一步研究CyHV-2的感染机制奠定了前期基础。 相似文献
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鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR 检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：1，他引：0
针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒.经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法.检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.9991,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107 copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号.取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104 copies/μL和3.02×102 copies/μL.本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义. 相似文献
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嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后的免疫应答反应与保护效果 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟(Acipenser schrenckii Brandt,1869)后的免疫应答反应与保护效果,本研究采用福尔马林灭活法制备嗜水气单胞菌灭活疫苗。通过腹腔注射途径免疫健康施氏鲟,对施氏鲟外周血的红细胞和白细胞数量、白细胞组成、吞噬活性、吞噬指数、血清酸性磷酸酶活性、血清溶菌酶活性、血清中和抗体效价等免疫指标及疫苗保护效果进行测定。结果显示,免疫组红、白细胞数量迅速上升,于免疫后第4天达峰值,分别为(8.50±0.17)×10~8个/mL和(8.96±0.44)×10~6个/mL;单核细胞和嗜中性粒细胞分类百分比于第7天达峰值,分别为10.50%和15.53%,极显著高于对照组(P0.01),淋巴细胞分类百分比在第21天才达峰值73.51%;吞噬指数和吞噬百分比均于第4天达到最高值,分别为4.53和30%;血清中溶菌酶活性和酸性磷酸酶活性分别在免疫后第7天和第14天达到峰值,极显著高于对照组(P0.01);血清抗体效价于免疫后第21天达到峰值1:203,极显著高于对照组(P0.01)。攻毒感染实验结果表明,免疫组的相对免疫保护率为76.84%。由此可见,嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后,能够显著诱导施氏鲟体内的免疫应答反应,增强鱼体的免疫保护能力。本研究为养殖鲟因嗜水气单胞菌感染引起疾病的免疫预防技术研究奠定了前期基础。 相似文献
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大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP 基因DNA 疫苗的构建及其免疫效果 总被引：5，自引：4，他引：1
根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因序列设计特异性引物,经PCR扩增得到MCP基因编码框1392 bp全长序列,将其定向克隆到真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒并命名为pc DNA-MCP。将pc DNA-MCP质粒转染大鲵肌肉细胞系(GS-M),间接荧光免疫染色结果显示,MCP蛋白可在GS-M细胞中表达,且转染后72 h的表达量显著高于转染后48 h;收集转染后72 h的GS-M细胞,经Western blot检测,可检测到MCP蛋白的特异性表达。将真核表达质粒pc DNA-MCP以20μg/尾的剂量经背部肌肉注射免疫健康大鲵(Andrias davidianus),分别在免疫后第1、3、5、7、14、21、28、35天随机从实验组与对照组中采样,尾静脉采血进行外周血血细胞计数、白细胞分类计数及测定血清中和抗体效价。结果表明,免疫大鲵体内红细胞、中性粒细胞和单核细胞数量明显增加,红细胞数在第5天极显著高于对照组(P0.01);中性粒细胞(neutrophil)分类百分比从第3天开始升高,第5天达到峰值(26.33±1.04)%,极显著高于对照组(P0.01);单核细胞(monocyte)的变化趋势和中性粒细胞相似,第7天达到峰值(15.83±0.76)%,极显著高于对照组(P0.01)。随后淋巴细胞大量增殖,第28天淋巴细胞分类百分比达到峰值(68.33±1.53)%,极显著高于对照组(P0.01)。血清中和试验结果表明,免疫大鲵体内产生了抗MCP蛋白的抗体,免疫后第28天抗体效价最高[1︰(370.01±31.55)]。真核质粒pc DNA-MCP在免疫大鲵的肌肉、肝、脾和肾的组织表达检测结果显示,免疫接种后第1、3、5、7、14、21、28天大鲵的肌肉、肝、脾和肾组织中均存在真核质粒的分布;RT-PCR结果显示,免疫后第7天和28天,在大鲵的上述组织中均有目的基因的表达。攻毒感染试验结果显示,免疫组大鲵相对免疫保护率可达73.3%。本研究为真核表达质粒pc DNA-MCP作为潜在候选疫苗应用于大鲵虹彩病毒病的预防和控制奠定了前期基础。 相似文献