绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选     

翟哲  陈思  吴艳茹  王雪梅  李崇瑞  刘志勇  陈巧玲  王凤阳  杜丽  李昌  金宁一 《中国畜牧兽医》2022,49(4):1213-1222

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。  相似文献   

2001年英国口蹄疫流行回顾   总被引：6，自引：0，他引：6  

郭志儒  金宁一 《中国兽医学报》2002,22(1):80-83,89

20 0 1年 2月 ,英国结束了自 196 8年以来 33年无大规模口蹄疫 (FMD)流行的历史 ,发生了全国性的口蹄疫大流行 ,使 1/8的家畜被杀 ,给农业、旅游和乡村度假业以及其他相关行业的发展造成了严重影响 ,英国的大选也不得不因此而延期。同时 ,疫情还波及到法国、荷兰和爱尔兰 ,造成  相似文献   

利用BrdU在CEF(TK~ )细胞中筛选TK~-重组鸡痘病毒   总被引：1，自引：0，他引：1  

郭志儒  金宁一  方厚华  罗坤  夏志平  殷震 《中国兽医学报》2001,(6)

将新城疫病毒 (NDV)四平株 HN基因 ,插入不含报告基因、以 TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体 p UTA- 2中的复合启动子下游 ,获得重组表达质粒 p UTA- 2 HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒 (FPV)感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,培养、收获病毒后 ,用含 40 m g/ L 5 -溴 - 2 -脱氧尿嘧啶 (Brd U )的培养液 ,在 CEF(TK )细胞中筛选培养 2代 ,然后用不含 Brd U的培养液进行病毒蚀斑纯化 ,成功筛选出表达 NDV HN蛋白的 TK-重组鸡痘病毒  相似文献   

HIV－1gag基因重组痘苗病毒的构建和高效表达     

毛春生  金宁一  殷震 《中国兽医学报》1996,(6)

Ｇａｇ蛋白是人Ⅰ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）重要的结构蛋白，可诱导机体产生体液和细胞免疫应答。本试验将ＨＩＶ－１不同长度的长末端重复序列（ＬＴＲ）和全长的ｇａｇＯＲＦ置于痘病毒启动子控制下，经过同源重组、红细胞吸附试验筛选和间接免疫荧光试验鉴定，分离了６株重组痘苗病毒。免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫酶试验检测表明，６株病毒均能表达ｇａｇ基因，其中以ｖ１６ＬＧ△２的Ｇａｇ蛋白表达量最高，占细胞裂解物上清的５．１９％，相当于１４．７μｇ／１０６细胞，接近杆状病毒的表达产量。重组蛋白主要为ｐ５５ｇａｇ蛋白前体，但也有一部分被加工，生成成熟蛋白ｐ２４ｇａｇ、ｐ１７ｇａｇ及其中间蛋白。表达的重组蛋白可形成病毒样粒子（ＶＬＰ），并可诱导小鼠产生抗Ｇａｇ蛋白抗体  相似文献   

疯牛病研究进展   总被引：3，自引：0，他引：3  

郭志儒  金宁一 《中国兽医学报》2001,21(3):307-311,316

疯牛病 ( mad cow disease)是牛海绵样脑病 ( bovinespongiform encephalopathy,BSE)的俗称 ,是动物传染性海绵样脑病 ( transmissible spongiform encephalopathy,TSE)中的一种 ,1 986年首先在英国发现 [1] ,然后传播到欧洲多个国家和地区 ,给英国和欧洲的养牛业造成了巨大损失 ,并影响到相关的用牛源材料的工业。特别是随着 BSE的流行 ,由同一致病因子引起的人的变异型克雅氏症( new variant Creutzfeldt-Jakob disease,nv CJD,v CJD)的出现 ,导致了全世界对疯牛病的恐慌。可以说 ,BSE已给动物和人类健康及国际贸易等领域带来全球…  相似文献   

农杆菌介导gag基因和gp120基因转化番茄的初步研究     

余云舟  王罡  金宁一  李昌  季静  王萍 《吉林农业大学学报》2003,25(4):374-377

以4个番茄品种为材料，通过对子叶和茎段培养，建立了番茄组织培养的再生体系，为番茄的遗传转化提供了良好的受体系统；通过农杆菌介导，初步将HIV—l的gag基因、apl20基因和gag-apl20嵌合基因导入番茄，得到了抗性转化再生植株，再生植株PCR检测结果呈阳性，从而建立了良好的番茄遗传转化体系。  相似文献   

植物基因工程疫苗的研究进展   总被引：1，自引：0，他引：1  

余云舟  王罡  金宁一 《沈阳农业大学学报》2003,34(3):236-240

植物基因工程疫苗是利用植物表达重组抗原蛋白来生产疫苗。作阐述了用转基因植物生产疫苗的基本原理和方法以及植物疫苗的优点，特别是食用疫苗的研究进展、优缺点及其应用前景。  相似文献   

植物乳杆菌α-半乳糖苷酶基因（melA）的克隆与序列分析   总被引：1，自引：1，他引：0  

任大勇  李昌  秦艳青  杜寿文  胡博  金宁一 《中国畜牧兽医》2011,38(1):95-99

试验以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增α-半乳糖苷酶基因（melA）基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacⅠ和Sph Ⅰ酶切及PCR扩增鉴定,并对melA基因片段进行序列测定。结果表明,测得的melA基因序列全长2240 bp,含有酶切位点、启动子、SD序列及编码738个氨基酸的开放阅读框,理论分子质量为84 ku;4种核苷酸中GC含量为47.45%、AT含量为52.55%;序列中有3个碱基发生了变化,均为无义突变,未导致其推导的氨基酸的改变;序列测定结果与GenBank中登录的序列进行比较,核苷酸和氨基酸序列的同源性除与AY873840相比分别为96.6%和92.2%外,其余均大于99%。试验成功克隆了melA基因,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。  相似文献   

口蹄疫病毒3AB基因的克隆与原核表达     

鲁会军  郑敏  韩松  李昌  金宁一 《广西农业生物科学》2006,25(Z1):115-118

根据口蹄疫流行毒株设计一对包含3AB部分基因编码区的特异性引物,扩增出3AB基因550 bp的特异带,并将纯化的扩增产物克隆到pM D 18-T载体上。再用设计的酶切位点将3AB基因分别连接到两种原核表达载体上,构建了重组质粒pETCK S-3AB及pET 28a-3AB,转入BL 21菌中进行原核表达。SDS-PAGE电泳表明,3AB基因在两种表达系统中均高效表达。对表达的蛋白通过包涵体及切胶纯化的方法进行纯化,获得了高纯度的3AB蛋白。  相似文献   

鸡痘病毒282E_4株TK基因重组载体质粒的构建   总被引：1，自引：0，他引：1  

顾万钧  金宁一  殷震 《中国兽医学报》1996,(3)

应用已克隆的鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ＿４株基因组ＴＫ基因，在ＮｃｏⅠ部位引入痘苗病毒Ｐ７．５启动子和Ｐ１１启动子控制下的大肠杆菌ＬａｃＺ基因，经酶切鉴定，成功地构建了用于ＦＰＶ重组的载体质粒。与亲本毒株在鸡胚成纤维细胞内共转染，产生了表达ＬａｃＺ基因的重组鸡痘病毒。经传代筛选、纯化，重组病毒较稳定。实验结果表明，以ＴＫ基因构建的重组载体质粒可用于外源基因的重组表达研究。  相似文献