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为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬IFN-γcDNA基因与GenBank上发表的序列一致,同源性100%。表达产物经Western-blot方法检测,证明克隆的犬IFN-γ基因能够在HEK293T细胞中进行表达,并且表达产物能够分泌到细胞外。 相似文献
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猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。 相似文献
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摘要: 安妥明处理大鼠的原代肝细胞，Western blot法和RT-PCR法检测孕烷受体(PXR)和细胞色素酶P450 3A1(CYP3A1)的表达情况。结果表明：安妥明可显著增强PXR的表达，该诱导作用可被放线菌素D所破坏。安妥明单独应用对CYP3A1无诱导作用，但与16α-碳腈孕烷醇酮(PCN)联合应用可增强PXR和CYP3A1的表达。安妥明为过氧化物酶体增殖因子之一，它对PXR和CYP3A1的诱导作用为揭示其药物代谢的分子机制提供了帮助。 相似文献
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猪细小病毒NS1基因的克隆、表达及密码子优化提高表达水平 总被引：1，自引：0，他引：1
通过PCR方法从猪细小病毒(PPV)基因组中扩增NS1基因,将其克隆到pcDNA3.1A质粒中,构建成与Myc/His标签融合的NS1真核表达载体。将表达载体转染PK-15细胞使其表达。利用猪偏爱的密码子对NS1全基因进行了密码子优化,通过构建表达载体和转染细胞,检测并比较了密码子优化前后的表达水平。结果显示:扩增的NS1基因与GenBank序列一致,构建的表达载体结构正确;Western blot检测表明,NS1基因能够在PK-15细胞中进行表达,但表达水平很低,有时检测不到,从而严重影响对其的进一步研究;密码子优化后NS1基因的表达水平由优化前的7μg/T25培养瓶增加至32μg/T25培养瓶,是原来的4倍。可见密码子优化可明显提高NS1蛋白在PK-15细胞中的表达,这为下一步研究NS1蛋白的功能提供了有利条件。 相似文献
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为构建犬细小病毒VP2基因分泌性表达细胞系,通过酶切将人CD5信号肽序列从质粒中切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1-CD5sp载体中CD5信号肽的下游,使其与CD5信号肽序列融合,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。经脂质体介导转染细胞,后通过G418筛选,建立出稳定表达VP2蛋白的CHO-K1细胞系。测序结果表明,构建的犬细小病毒VP2基因的分泌型表达载体结构正确,表达载体经脂质体介导转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出稳定转染VP2基因的细胞株,经PCR检测证明VP2基因已经整合到细胞的染色体中;经RT-PCR、Westernblot分别检测VP2基因表达的mRNA和VP2蛋白,证明犬细小病毒VP2基因能够在CHO-K1细胞进行稳定性表达。这为下一步研究犬细小病毒VP2蛋白与宿主细胞的相互作用及VP2DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
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红星苹果多酚氧化酶某些特性及其抑制剂的研究 总被引：50，自引：3，他引：47
用硫酸铵分级盐析及透析法提取红星苹果ＰＰＯ,并分别测定了该酶的最适ｐＨ、最适温度及酶促动力学参数Ｋｍ值和Ｖｍａｘ值,比较分析了常见几种ＰＰＯ抑制剂的抑制作用,结果表明：以邻苯二酚为底物,苹果ＰＰＯ的最适ｐＨ为６．２,最适温度为２８℃,Ｋｍ值为４１ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ值为２３５．３ｕｎｉｔ／ｍｉｎ。在所测５种抑制剂（Ｌ－半胱氨酸、偏二亚硫酸钠、硫脲、谷胱甘肽、抗坏血酸）中,Ｌ－半胱氨酸、偏二亚硫酸钠和抗坏血酸对苹果ＰＰＯ表现出较强的抑制作用,并以Ｌ－半胱氨酸最强。 相似文献
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含第一内含子猪生长激素cDNA基因在COS7细胞中的表达 总被引：4，自引：1，他引：3
以CMV真核生物启动子构建了含第一内含子猪生长激素（pGH）cDNA基因（pGHcDNA-in）的表达载体，经DEAE-葡聚糖介导在COS7细胞进行了瞬时表达，通过PP95生物学测定法测定，证明含第一内含子pGHcDNA基因能够在真核细胞中进行分泌性表达，表达出的pGH具有生物学活性。这说明通过该基因转录出的前体mRNA能够在COS7细胞中进行正确剪接，从而翻译出具有生物活性的pGH。加入第一内含子在一定程度上可提高pGHcDNA基因的表达效率。 相似文献
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犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平. 相似文献
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为弄清犬白介素-15(cIL-15)能否增强犬细小病毒VP2DNA疫苗的免疫原性,本研究首先通过RT-PCR方法从犬脾脏淋巴细胞中扩增全长cIL-15cDNA基因,并构建其与Myc-His-tag融合和非融合的表达载体:pcDNA-cIL-15/MH和pcDNA-cIL-15。将pcDNA-cIL-15/MH载体转染HEK293T细胞,确定构建的表达载体能否介导cIL-15进行分泌表达。利用过去构建的VP2表达载体和pcDNA-cIL-15载体共免疫小鼠,用ELISA检测免疫后小鼠血清中的抗体滴度,并用MTT检测小鼠淋巴细胞的增殖活性和用ELISA测定淋巴细胞干扰素-γ和IL-4的表达。结果显示,构建的cIL-15表达载体能够介导cIL-15在真核细胞中的分泌表达。用VP2和cIL-15表达载体共免疫小鼠,抗体水平明显高于VP2载体单免疫组(P0.01)。当免疫35d时,共免疫组淋巴细胞的刺激指数、干扰素-γ和IL-4的表达水平均明显高于VP2载体单免疫组(P0.05)。结果表明,cIL-15可明显增强VP2DNA疫苗的免疫原性。 相似文献
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为探讨犬细小病毒(CPV)引起宿主细胞凋亡的分子机制,用CPV感染MDCK细胞,感染后通过台盼蓝染色法检测不同时间的细胞存活率,用Annexin V-FITC/PI法检测磷脂酰丝氨酸外翻情况,用试剂盒检测Caspase-3活性,分析CPV诱导细胞的凋亡。并通过流式细胞术检测细胞线粒体的损伤和ROS的产生探讨其分子机制。结果显示,随着病毒感染时间的不断延长,CPV可明显降低MDCK细胞存活率,促进磷脂酰丝氨酸外翻,增强Caspase-3活性,表明CPV可引起细胞凋亡。同时还发现CPV可明显提高细胞内ROS的水平,引起线粒体的损伤,这可能是CPV诱导细胞凋亡的重要分子基础。由此可见,CPV诱导MDCK细胞凋亡与CPV增加细胞ROS的产生和线粒体的损伤有关。 相似文献