家畜转基因抗病育种研究进展     

田永祥  曹宏云  杨克礼  段正赢  梁望旺  伍锐  郭锐  刘泽文  徐涤平 《湖北农业科学》2010,49(12)

人们一直期望畜产品产量和动物健康水平能快速得到提高,DNA重组技术和转基因技术的出现使得其在不同物种间,甚至不同系统发育领域间成为可能。转基因、动物克隆等技术的进步在一定程度上已经实现了在动物转基因领域的期望。本文讨论了当前家畜转基因技术和转基因抗病育种的研究近况,并对转基因抗病动物的发展进行了展望。  相似文献   

规模猪场种猪伪狂犬病血清抗体和病原检测与分析     

熊忠良  梁望旺  杨克礼  伍锐  刘泽文  赵海忠  邓均华  徐涤平 《湖北农业科学》2009,48(9)

采集武汉市两个规模猪场的370头份种猪血液和鼻拭子样本,运用ELISA方法对血清样本进行猪伪狂犬病抗体检测,结果两个猪场种猪的伪狂犬病gB抗体平均阳性率分别为77.1%和77.9%,猪伪狂犬病gE抗体平均阳性率分别为2.4%和3.9%;运用PCR方法对种猪鼻拭子样本进行猪伪狂犬病病原检测,结果显示,猪伪狂犬病病毒的阳性率分别为1.2%和5.4%.检测结果对猪场伪狂犬病的控制和净化具有指导意义.  相似文献   

口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型分型基因芯片的构建与评价     

刘志鹏  欧阳达  黄小波  滑翔  赵玉佳  曹三杰  文翼平  伍锐  赵勤  文心田 《农业生物技术学报》2018,(2)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种高度接触传染性动物疫病。本研究拟建立一种能区分FMDV O/A/AsiaⅠ型的基因芯片。根据FMDV O/A/AsiaⅠ型的VP1基因序列设计3对特异性引物,用RT-PCR扩增获得248、206和239 bp的三个靶基因片段,并针对这三个片段分别设计了3种探针,以引物荧光标记法标记靶基因,建立了一种鉴别FMDV O/A/AsiaⅠ型的分型基因芯片并进行了敏感性、特异性、重复性和保存期评价。结果表明最佳反应条件为:水化温度37℃,封闭液为0.25%BH_4Na/25%乙醇,杂交温度为42℃。灵敏性实验表明,FMDV-O检测限为118 pg/mL,FMDV-A为18.4 pg/mL,FMDV-AsiaⅠ为129 pg/mL,芯片方法灵敏度比常规RT-PCR高10~100倍;特异性实验表明,O、A和AsiaⅠ三型之间无交叉杂交;该芯片可至少保存3个月仍能重复使用。本研究建立的FMDV分型基因芯片为O、A和AsiaⅠ型鉴别提供了新方法。  相似文献   

稳定表达SLAM受体的Vero和BHK21细胞系的建立及其对犬瘟热病毒分离效果的比较     

朱璐  燕霞  代科  王正皓  赵玉佳  杨振  文心田  曹三杰  黄小波  伍锐  赵勤  文翼平 《畜牧兽医学报》2018,(6)

旨在构建稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,并比较其对犬瘟热病毒(CDV)野毒株的敏感性,为CDV野毒株的快速分离与研究提供一种有效的工具。将真核表达载体Pcag-SLAM分别转染Vero细胞和BHK21细胞。经G418压力筛选结合有限稀释法筛选阳性克隆株,并通过RT-PCR、间接免疫荧光鉴定(IFA)和Western blot等方法对稳定表达SLAM受体的SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系加以验证。应用这两种细胞系对3例临床犬瘟热病例的5种不同组织进行病毒分离,对分离得到的CDV进行RT-PCR及IFA鉴定。结果显示,经RT-PCR和Western blot验证,本研究成功构建出SLAM-Vero细胞系和SLAM-BHK21细胞系,SLAM-Vero细胞接种病毒12~24h即可出现典型的CDV导致的细胞融合体CPE,利用SLAM-Vero细胞从3只CDV阳性犬的肺和脾中分离得到2株CDV,而SLAM-BHK21细胞、亲本Vero细胞及亲本BHK21细胞未能分离出病毒。研究表明,与SLAM-BHK21细胞相比,SLAM-Vero细胞对CDV的分离率较高,并能产生明显的CPE。在分离CDV野毒株时,选择肺和脾更容易在SLAM-Vero细胞系上分离出病毒。  相似文献   

猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用     

马锐  黄小波  杨国淋  滑翔  赵玉佳  文心田  曹三杰  文翼平  伍锐 《农业生物技术学报》2016,(8):1233-1242

基因芯片标准化是其特异灵敏检测病原的基本保障,本研究针对金标银染可视化基因芯片制备中点样缓冲液的使用、点样次数、杂交温度、杂交时间、胶体金浓度以及银染时间分别进行优化实验,分析其对金标银染可视化共检基因芯片杂交信号的影响.分别选取猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(Group A porcine rotavirus,GAR)的VP7和NSP4基因设计引物.根据目的基因片段设计5’端修饰有15个T碱基的60-mer寡核苷酸探针,分别以1∶1混合点样缓冲液和直接进行喷样两种方式,利用芯片点样仪喷样分别喷样1次、2次、3次于醛基玻片上制成基因芯片.应用不对称PCR对实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记,分别在40、45、50和55℃与基因芯片杂交30、60、90和120 min.利用生物素-链霉亲和素的特异性链接,分别将稀释10、20、30、40、50及60倍的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系,通过不同银离子染色时间后后,直接眼观实验结果.应用优化后的标准化可视化芯片和RT-PCR同时对173份临床送检病料进行检测,以评价芯片临床应用.结果表明,应用探针和点样缓冲液1∶1混合的方法进行1次喷样制作的基因芯片,在50℃环境中杂交90 min后,与4μg/mL链霉亲和素修饰的纳米金颗粒结合,再进行12～14 min银染,经过10次重复性实验,可确定为金标银染可视化基因芯片的最佳优化条件.临床病料可视化芯片检测结果与RT-PCR检测结果一致.本研究确定了病毒性腹泻可视化共检芯片的最佳反应条件,为该技术的临床应用标准化研究奠定了基础.  相似文献   

海上低渗气藏定向井压裂经济开发地质下限探讨     

严申斌  黄导武  伍锐东 《长江大学学报》2016,(26):61-64

介绍了东海低渗气藏的地质特征,分析了东海低渗气藏定向井压裂的3种开采特征,即高产平稳型、中产快速递减型、低产平稳型。通过机理模型研究了动用储量、储层渗透率、裂缝长度、裂缝宽度等参数对低渗气藏产能的影响。在此基础上,探讨了3种不同工况条件(即已有生产井兼顾、已有平台新钻井、新建平台依托开发)下海上低渗气藏定向井压裂经济开发的地质储量下限。在目前经济条件下,建议海上低渗气藏开发以现有生产井深层兼顾和已有平台新钻井压裂开发为主。  相似文献   

2020-2022年华中地区部分猪场猪圆环病毒3型的分子流行特征与遗传变异分析     

李博天  李春琪  刘国平  谢军  曾攀  赵润泽  李桐  裴洁  郭利伟  伍锐  谭磊 《中国农业科学》2024,(3):613-626

【目的】通过系统性试验方案摸清我国华中部分地区猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3)流行病学及遗传变异特点,为PCV3疫苗研究提供数据基础。【方法】对华中地区(湖北、湖南和河南)15个规模化养猪场的3 500份临床采集样品进行real-time PCR检测,分析不同猪群、不同组织器官、不同排毒量和对应流行病学症状特点关系。对部分阳性样本PCV3全基因组进行扩增、测序和分析。【结果】50.86%(1 780/3 500)被检样本为PCV3核酸阳性,不同发育阶段猪群PCV3均易感,保育猪、哺乳仔猪、生长育肥猪PCV3阳性率较高,分别为70.44%(498/707)、67.19%(596/887)、41.75%(177/424)。在不同组织器官和样品中,淋巴结、肺脏、产后胎盘样本PCV3阳性率为67.05%(59/88)、63.79%(74/116)、49.11%(55/112),血液、初乳样本PCV3阳性率分别为56.09%(502/895)、44.20%(278/629),且鼻拭子和唾液中均检出PCV3。出现猪繁殖障碍症状、厌食症状和呼吸障碍症状的猪群PCV3阳性率高...  相似文献   

动物沙门氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药性及GyrA基因的突变研究     

邓均华  徐涤平  伍锐  梁望旺  杨克礼  熊忠良 《湖北农业科学》2009,48(7)

用纸片扩散法和微量稀释法测定动物沙门氏菌(Salmonella)对氟喹诺酮类抗菌药物的耐药性,PCR扩增沙门氏菌GyrA基因的喹诺酮耐药决定区(Quinolone resistance determining regions,QRDR),扩增的片段长度为487bp,PCR产物直接测序,用DNAstar软件分析氨基酸序列.结果显示,盐酸环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星和烟酸诺氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)范围分别为16～128μg·mL-1、32～128 μg·mL-1、32～256μg·mL-1、128～512 μg·mL-1和64～512 μg·mL-1.GyrA基因QRDR的突变位点均位于83和87位氨基酸位点,主要的变异方式为Ser83→Phe(12/15)和Asp87→Asn(10/15),其次为Asp87→Tyr(5/15)和Ser83→Gly(3/15).同时发现QRDR外的119位氨基酸也发生了变异(Ala119→Val),说明试验用菌株对氟喹诺酮类药物均表现为多重耐药,其GyrA基因QRDR的突变表现为多种形式.  相似文献   

母猪接种PRRS疫苗预防PRRSV垂直传播的效果     

杨克礼  梁望旺  伍锐  刘泽文  邓均华  段正赢  熊忠良  徐涤平 《湖北农业科学》2009,48(12)

用灭活疫苗和减毒活疫苗分别对10头母猪进行免疫.选择20头后代,在20日龄、30日龄、40日龄时分别采集血样进行跟踪监测.结果PRRS的抗体阳性率分别为30%、15%、5%和35%、20%、5%.显示用两种疫苗免疫的母猪后代体内获得性母源抗体水平均不高,且持续时间较短.因此,仅靠对母猪进行免疫难以预防PRRSV的垂直传播.  相似文献   

猪丁型冠状病毒S1基因的克隆、原核表达及多克隆抗体制备   总被引：1，自引：1，他引：0  

李成  张雨迪  黄小波  刘浩宇  刘志鹏  赵玉佳  曹三杰  文心田  文翼平  赵勤  伍锐 《畜牧兽医学报》2018,(6)

本研究旨在克隆猪丁型冠状病毒(PDCoV)S1基因(1—1 566bp),体外表达S1基因抗原表位预测区Sa(106—1 290bp)蛋白并制备抗该蛋白质的多克隆抗体。运用生物信息学软件分析S1核苷酸和编码氨基酸序列特征,将S1基因抗原表位预测区Sa克隆至原核表达载体pET22b(+),构建重组表达载体pET22b-Sa,转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG诱导表达、超滤柱浓缩纯化重组蛋白、Ni柱亲和层析,Western blot检测Sa蛋白的活性,将Sa蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果表明,CHN-2015毒株S1基因开放型阅读框大小为1 566bp(GenBank No.KY398009),编码522个氨基酸,是具有亲水性的非跨膜蛋白,存在15个潜在的B细胞抗原表位;原核表达Sa重组蛋白,该蛋白质在37℃下用终浓度为0.8mmol·L~(-1)IPTG诱导5h后,蛋白质主要以可溶性形式存在,免疫印迹显示表达的Sa蛋白在上清与包涵体中都有良好的反应性;用纯化的Sa蛋白四次免疫家兔,获得的兔抗Sa蛋白抗体效价可达1∶10 240。本研究克隆了S1基因,原核表达了Sa蛋白和制备了高效价的兔抗Sa蛋白抗体,具有良好的免疫原性,为后续深入开展S蛋白的功能研究奠定了基础。  相似文献