口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定   总被引：2，自引：0，他引：2  

曹伟军  李平花  白兴文  卢曾军  孙普  刘在新 《华北农学报》2010,25(3)

利用定点突变方法,构建含有预期突变的口蹄疫病毒O/HN/93株全长cDNA克隆,将全长cDNA的重组质粒线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,转染细胞盲传至第3代50 h后出现典型致细胞病变效应(CPE),第4代10 h出现典型的CPE。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光和电镜观察等进行鉴定,均证实成功拯救到了O/HN/93株FMDV。成功获得O/HN/93株的感染性分子克隆,为进一步研究抗原谱广、免疫原性好的候选疫苗株奠定了骨架基础。  相似文献   

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒     

卢曾军  曹轶梅  包惠芳  刘在新  赵启祖  陈应理  常惠芸  谢庆阁 《畜牧市场》2009,(9):14-16

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有0型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P12A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质柱用Pinel线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv—P12×5c和pAdcmv—p12×3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经Pacl线性化后转染HEK295细胞,转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24～48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT—PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。  相似文献   

口蹄疫病毒非结构蛋白2C主要表位区的原核表达及其单克隆抗体的制备   总被引：4，自引：0，他引：4  

田美娜  李永亮  付元芳  卢曾军  袁明  WU Lei  吴磊  刘在新 《中国预防兽医学报》2009,31(1)

本研究制备并鉴定了口蹄疫病毒非结构蛋白2C的单克隆抗体(mAb).以纯化的原核表达2C蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,所获得的杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆,直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体,用Dot-ELISA以及IFA对mAbs的特异性等进行鉴定.共获得4株抗重组蛋白2C的mAbs,其亚类鉴定结果3株为IgG1,1株为IgG2b,叠加ELISA初步判定4株单抗所识别表位相同或相近.Dot-ELISA显示这些mAbs与重组2C蛋白和(2C3AB)蛋白以及口蹄疫病毒O/China99感染的BHK-21细胞中的2C抗原均可特异性结合,IFA结果显示所得单抗能与FMDV感染细胞中的2C蛋白特异性结合.本研究获得的针对2C蛋白的特异性mAb,为进一步研究2C蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定了基础.  相似文献   

口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达   总被引：5，自引：1，他引：4  

曹轶梅  刘在新  卢曾军  郭建宏  常惠芸  谢庆阁 《畜牧兽医学报》2004,35(1):115-118

将牛源O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)China／99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM-T-3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx-4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx-3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE可检测到分子量约为59．1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31．4％。Western blotting分析证明表达产物能被FMDv阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。  相似文献   

用3''RACE方法扩增并克隆口蹄疫病毒基因组3''末端序列   总被引：1，自引：0，他引：1  

刘光清  刘在新  谢庆阁 《中国兽医学报》2003,23(6):524-526

应用3’RACE方法扩增并克隆了口蹄疫病毒(FMDV)0H99株基因组3’端真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长1500nt,包括3D基因部分序列、3’端非编码区(Non—Coding Region,NCR)和Poly(A)尾巴,其中3’NCR位于终止密码子TAA之后,长93nt,Poly(A)尾序列至少含有56个A。与参考毒株进行序列比较,结果显示,OH99株与0TY TW／97株的核苷酸同源性较高,为91．4％,而与O1K、CHINA99、A12等毒株的核苷酸同源性较低,其同源性分别为68．1％、71．0％、70．2％。3’NCR的末端存在保守性较高的基序：CCCTCAGATG,TTTTCCC—CGCTTCCT。本研究为进一步研究FMDV基因组的功能、构建OH99株的反向遗传操作系统奠定了基础。  相似文献   

佐剂及其在基因免疫研究中的应用     

郭慧琛孙世琪  刘在新 《中国兽医科技》2005,35(4):315-321

论述了免疫佐剂的作用机理及细胞因子、CpGDNA、化学佐剂、共刺激信号分子、化学因子、黏附分子等佐剂在基因疫苗中的应用概况，并对免疫佐剂在基因疫苗中的应用前景进行了展望。  相似文献   

Asia1型口蹄疫病毒VP1基因的克隆、原核表达及纯化     

独军政  常惠芸  丛国正  林彤  邵军军  魏小娟  刘在新  谢庆阁 《畜牧兽医学报》2005,36(6):631-634

口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病，该病被国际兽疫局列为A类传染病之首，对畜牧业危害极大，是世界各国检疫和防疫的重点对象。目前已知该病毒有7个血清型，  相似文献   

用大肠杆菌表达FMDV NSP 3ABC鉴别感染与注苗动物ELISA方法的建立   总被引：11，自引：2，他引：9  

曹轶梅  卢曾军  刘在新  谢庆阁 《畜牧兽医学报》2005,36(4):381-386

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法.用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准.3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样品效价.当效价小于0.2为阴性,介于0.2～0.3之间为可疑,大于0.3为阳性.根据此判定标准所测试验感染动物血清都为阳性,敏感性达100%;97.06%疫苗注射动物血清为阴性;98.39%的非免疫健康牛(未感染也未注射疫苗牛)血清为阴性.研究证实感染牛在1年以后仍能检测到3ABC抗体.这说明3ABC-I-ELISA能够鉴别FMDV感染动物和注苗动物,可作为大面积疫情监测的方法应用.  相似文献   

口蹄疫病毒持续性感染形成原因的探讨   总被引：3，自引：0，他引：3  

刘光清刘在新  谢庆阁 《中国兽医科技》2003,33(4):35-40

  相似文献   

固定细胞免疫过氧化物酶技术     

刘在新 《甘肃畜牧兽医》1993,23(2):37-38

固定细胞免疫过氧化物酶技术是近年推出的新方法,用于检测和分析病毒诱导抗原及细胞表面受体,是细胞酶联免疫吸附试验(ELISA)的发展。这种技术克服了以前许多方法的不足。现将其原理、方法及应用情况浅述如下:一、原理将病毒感染的单层细胞或靶细胞用化学试剂(多聚甲醛或丙酮)固定在微量平底96孔塑料培养板上,加适量的特异性抗体(单抗)作用后洗涤,用过氧化物酶标记的抗小鼠 FC 抗体封闭抗原抗体复合物,然后加底物 H_2O_2,终止反应后测其415nm的 OD 值。二、方法1.病毒感染细胞敏感细胞以单层培养在96孔平底塑料培养板上,待细胞生长成密集的单层,  相似文献