含74个腺嘌呤poly（A）尾的猪水泡病病毒HK／70株3’非编码区的克隆及其特征分析     

郑海学刘湘涛  尚佑军吴锦艳 冯霞白兴文  田宏孙世琪  尹双辉郭建宏刘在新  谢庆阁 《中国兽医科技》2006,36(1):7-12

应用3’RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒（SVDV）HK／70株基因组3’端的真实序列。测序结果表明，所扩增的目的基因片段长4200nt，包括非结构蛋白编码区（P2和P3）、3’端非编码区和poly（A）尾，其中3’NTR位于终止密码子TAA之后，长99nt，poly（A）至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较，结果显示，HK／70株与J1’73、H／3’76和AUG／22／90株的核苷酸同源性较高，为99．0％（仅第65位碱基不同），而与NET／1／92参考毒株的核苷酸同源性较低，为83．3％，与人柯萨奇病毒B5UK／54株（UK／54-CB5）的同源性为75．7％。同时对3’NTR的二级结构进行分析，并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明，它们具有协同变异性，有共同的祖先，显示出3’NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。  相似文献   

口蹄疫病毒株China/99 P3区一级结构及与参考毒株的比较分析   总被引：2，自引：0，他引：2  

张显升  赵启祖  刘在新  江鹏斐  常惠芸  陈应理  李冬  魏怀录  谢庆阁 《畜牧兽医学报》2002,33(6):606-610

用RT－PCR法，以口蹄疫病毒China/99感染的牛舌水泡皮为材料，扩增目的cDNA，与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株，再经重组质粒电泳、PCR和EcoR1酶切鉴定。序列测定和分析结果表明，猪源毒在3A基因内缺失10个密码子，与牛源毒的核苷酸和氨基酸序列差异较大。A－G和T－C的转换率较高，而且A－G转换导致氨基酸变异的几率大于T－C转换，它们是影响氨基酸稳定的因素之一。China/99P3区编码产物在第8、120、121、127、132、193、493、501和538位具有特征性氨基酸，可能与该毒株的表型如毒力等有关。3A基因突变率较高，3B、3C和3D较低，3D最为保守，这对维持3C和3D蛋白酶和3B的引物功能至关重要。  相似文献   

口蹄疫基因疫苗研究进展   总被引：2，自引：0，他引：2  

郭慧琛  刘在新  孙世琪  刘光清  谢庆阁 《动物医学进展》2003,24(4):1-5

口蹄疫是一种危害严重的偶蹄动物传染病 ,研制新型口蹄疫疫苗是防治口蹄疫爆发的有效措施之一。自 1 990年首次出现基因疫苗的研究报道之后 ,基因疫苗已成为疫苗研究领域中的一大热点。文章介绍了近年来国内外在口蹄疫基因疫苗研究方面的新进展 ,包括口蹄疫基因疫苗构成的基本条件、口蹄疫基因疫苗的免疫机理、口蹄疫基因疫苗的不同免疫形式以及免疫佐剂在口蹄疫基因疫苗研究中的应用 ,并对口蹄疫基因疫苗的发展前景进行了讨论  相似文献   

口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因在毕赤酵母中的表达   总被引：4，自引：0，他引：4  

张腾国刘在新  谢庆阁 《中国兽医科技》2004,34(1):8-11

以口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)RNA聚合酶基因3D为研究对象，对其部分碱基进行定点诱变，替换成在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。改造后的目的片段用NotⅠ和AvrⅡ内切酶双酶切，然后与相应内切酶双酶切的穿梭载体pPIC9K相连接，构建重组表达载体pPIC9K／3D，转化大肠埃希氏菌JM109，筛选阳性克隆pPIC9K／3D。经测序表明，插入位置、突变碱基、片段大小和读码框均正确。重组质粒用SacⅠ内切酶线化，电转化毕赤酵母SMD1168，采用G418抗性梯度法筛选，获得高拷贝整合重组菌株SMD1168／pPIC9K／3DHIS^ MUT^ ，利用甲醇进行诱导分泌表达，经SDS-PAGE和Western blotting鉴定，3D基因在毕赤酵母中表达成功，目的蛋白分子质量大小为52ku，与预期的大小吻合，并能够被FMDV阳性血清所识别，表达量占总分泌蛋白量的36％。  相似文献   

腺病毒载体在基因治疗和疫苗研究中的应用     

卢曾军  曹轶梅  刘在新  谢庆阁 《畜牧市场》2009,(3)

自从20世纪50年代开始认识腺病毒(Adenovirus)以来,对腺病毒的生物学和免疫学特征已经有比较多的认识.腺病毒科包括禽腺病毒属(Aviadenovius)和哺乳动物腺病毒(Mastadenov irus)两个属.除人腺病毒以外,一些哺乳动物的腺病毒和禽腺病毒也成为基因治疗和载体疫苗研究的热点,如猪腺病毒3型(PAV-3)[1～5]、牛腺病毒3型(BAV-3)[6、7]、绵羊腺病毒(Ovine adenovirus,OAV)[8]、禽腺病毒(Aviadenovirus)[9,10]、犬腺病毒(Canine adeno、virus,CAV)和黑猩猩腺病毒(Chimpanzee adeno-virus).  相似文献   

口蹄疫多基因杆状病毒转移载体的构建     

云涛  冷青文  郭慧琛  刘在新  张居农  谢庆阁 《动物医学进展》2004,25(4):104-106

采用分步 PCR扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因 P1 ,非结构蛋白基因 2 A、2 B、3 C蛋白酶和 3 D聚合酶按正确的读码框依次连接克隆入 p GEM-T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入杆状病毒转移载体 p Mel Bac B。构建成功的重组 p Mel Bac B/P1 2 X3 C3 D转移载体经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,转移载体可与杆状病毒骨架载体进行昆虫 sf9细胞内同源重组 ,以产生重组杆状病毒  相似文献   

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的可溶性表达与生物活性分析     

祝秀梅;刘在新 《农业生物技术学报》2008,16(1)

通过设计特异性引物扩增得到完整的口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白（NSP）3AB基因,定向克隆到表达载体pET-30a中,获得了重组质粒pET-3AB,并转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),重组菌分别在37℃和28℃条件下诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,观察到37℃培养条件下目的蛋白形成包涵体,在28℃条件下培养目的蛋白以可溶性的形式表达。Western blotting分析表明,表达的目的蛋白能与FMDV感染牛血清发生特异性反应。以纯化的3AB蛋白作为抗原,采用间接ELISA模式检测了部分FMDV感染动物血清和健康动物血清,证明表达蛋白与FMDV感染血清有很好的反应而与健康动物血清无反应。该项研究为建立以3AB为抗原的FMDV NSP抗体检测ELISA方法奠定了基础。  相似文献   

兰州地方分离PCV毒株ORF2阅读框的测序分析与原核表达鉴定     

傅昱  郝晓芳  卢曾军  孙普  胡永浩  刘在新 《湖南农业科学》2010,(7)

根据GenBank中发表的PCVl和PCV2的ORF2基因序列,设计合成了一对共用引物,用PCR的方法从兰州本地病料中分离出毒株,通过PK-15的增殖,扩增出ORF2序列,测序分析后发现分离毒株序列与PCVI的ORF2序列同源性达到99.1%～99.4%.根据GenBank中PCV2的ORF2序列对目的序列进行了改造、优化和合成后,目的序列和pET-32 a载体连接.转化BL21(DE3)细胞后,挑取阳性克隆.对鉴定后的融合质粒用IPTG诱导,裂解液经过SDS-PAGE分析、纯化操作和Western-Bloting分析,表明改造合成ORF2序列在大肠杆菌中得到了表达,并能被PCV2阳性血清所识别.  相似文献   

口蹄疫病毒VP31基因在昆虫细胞中的表达     

孙甲川  曹轶梅  卢曾军  刘在新  魏彦明 《甘肃农业大学学报》2009,44(5)

研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达.  相似文献   

口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定   总被引：2，自引：0，他引：2  

李永亮  田美娜  卢曾军  杨苏珍  付元芳  曹轶梅  刘在新 《江苏农业学报》2009,25(2)

用E.coli原核表达并纯化的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)非结构蛋白3B免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA筛选出分泌鼠IgG的杂交瘤细胞株,将该杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水,用间接ELISA法筛选获得6株能稳定分泌抗3B蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、4B1、4D7、4E11、7B2、8B11.鉴定结果显示,4B1和4E11细胞分泌IgG1,其余4株细胞分泌IgG2b;纯化后6株腹水单抗的纯度达90%以上,对3B蛋白的ELISA滴度均可达到1:100 000以上;6株单抗均不与FMDV结构蛋白VP1和3D非结构蛋白发生反应;间接免疫荧光试验证明所制备的单抗能够识别3B蛋白;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存6个月后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定.  相似文献