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121.
将pET28b-Rv1400c重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,筛选出阳性菌株并增菌培养后IPTG诱导表达,离心后沉淀用SKL变性溶解,用亲和层吸树脂纯化Rv1400c蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白表达与纯化情况;利用Rv1400c蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;Western-blot分析鹿结核阳性血清的反应情况。SDS-PAGE和Western-blot结果显示:Rv1400c以包涵体形式表达,蛋白分子质量为39 ku;目的蛋白免疫新西兰兔后,ELISA检测血清效价达到1∶51 200。纯化的Rv1400c重组抗原蛋白能与鹿的阳性血清发生体外结合反应。 相似文献
122.
123.
为了确定齐齐哈尔市某山羊养殖场疑似患有伪结核病病羊的病原及其毒力,试验从不同病羊的皮下脓包中采集脓汁病料3份,通过细菌的分离与纯化、生化鉴定、16S rDNA基因的PCR扩增与序列分析确定病原,并通过致病性试验对分离株的毒力进行评价。结果表明:共得到3株分离株,其菌落形态和生化特性菌与伪结核棒状杆菌相符,分别命名为CP045、CP073、CP969;分离株CP045、CP073、CP969的16S rDNA基因序列与伪结核棒状杆菌参考株的相似性分别高达98.8%、100%、99.8%,进一步确定3株分离株均为伪结核棒状杆菌。注射分离株CP073的3只小鼠中有2只于注射后36~48 h陆续死亡,1只精神极度沉郁、食欲不振;注射分离株CP045、CP969的3只小鼠于注射后5 d内均未见死亡,但状态不佳。注射分离株CP045、CP073、CP969的小鼠肝脏均不同程度出血、肿大,脾脏轻微出血;注射分离株CP073的小鼠皮肤表面有黄色脓汁渗出,皮下有黄白色玉米粒大小的结核样脓肿;注射分离株CP045和CP969的小鼠皮下未见明显脓肿。说明该山羊养殖场疑似患有伪结核病的病羊感染了伪结核棒状杆菌... 相似文献
124.
125.
126.
牛分枝杆菌二价组合及融合DNA疫苗的免疫效果 总被引:2,自引:0,他引:2
利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64基因和ag85b-mpb64融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建二基因融合(pCDNA-MPB64/Ag85B,pCMA)和二价组合(pCDNA-Ag85B+pCDNA-MPB64,pCA+pCM)DNA疫苗.以牛分枝杆菌卡介苗(BCG)为阳性对照,以pCDNA3.1(+)和PBS为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ及IL-2分泌情况.结果显示:融合DNA疫苗组免疫小鼠血清抗体水平、刺激值(SI值)及IFN-γ和IL-2的分泌水平均明显高于其他各组(P<0.05).二价组合DNA疫苗组的体液和细胞免疫指标与BCG组相当(P>0.05),而显著高于两阴性对照组(P<0.05). 相似文献
127.
猪瘟病毒E2蛋白抗原单表位基因的融合表达及其免疫活性的研究 总被引:2,自引:2,他引:2
利用基因搭桥技术,在Klenow DNA聚合酶作用下,分别合成猪瘟病毒E2蛋白的3个抗原表位基因,并与原核表达载体pGEX-3X进行连接、转化和筛选鉴定,构建了3个重组质粒pGEX-C、pGEX-D和pGEX-E。在IPTG的诱导下.实现了可溶性蛋白的融合表达(GST-C、GSTD、GST-E),以GST亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。应用ELISA和Western-blot检测证实:E抗原表位基因表达的融合蛋白GST-E具有免疫学活性,而C和D的抗原表位基因虽然都表达了融合蛋白GST-C和GSTD,但未检测到免疫学活性。免疫攻毒保护试验表明:融合蛋白GST-E具有一定的免疫保护功能,为多表位疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
128.
牛分支杆菌热休克蛋白65基因的分子克隆和表达 总被引:4,自引:1,他引:4
以牛型分枝杆菌Vallee菌株基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增热休克蛋白65(Hsp65)基因,PCR产物经纯化与EcoRⅠ/SaⅠ双酶切后与经同样处理的原核表达载体pGEX-6P-1进行连接,转化感受态细胞BL21中,筛选和构建了原核重组表达质粒pGEX-H65,核苷酸序列测定验证其正确性.以1 Mol/LIPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,Hsp65基因表达的融合蛋白GST-H65裂解为两部分;即64 kD和22 kD,两个蛋白分子量相加与预测的86 kD(HsP60 kD GST26 kD)相符.牛分支杆菌热休克蛋白HSP65的成功表达为其功能的研究打下基础. 相似文献
129.
本研究根据金黄色葡萄球菌(Staphylococcus auretls,SA)耐热核酸酶(nut)基因、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi,ST)鞭毛抗原(H1-d)基因和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)热稳定直接溶血素(tdh)基因,分别设计了三对引物Nuc-F/Nu-R、H1-d—F/H1-d—R和Tdh-F/Tdh-R,预计PCR扩增的DNA片断分别为279bp、202bp和458bp。通过对单个基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件如引物浓度、退火温度和dNTP浓度等的优化,建立了快速检测金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和副溶血弧菌的单管多重PCR方法,该方法检测的敏感性分别为:47.8PgST的基因组DNA.22.7PgSA的基因组DNA和0.3745PgVP的基因组DNA。模拟试验显示最低检测限度为分别为:SA150CFU/反应体系,ST98CFU/反应体系,VP53CFU/反应体系。表明该方法具有很好的应用价值和开发前景。 相似文献
130.