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11.
为建立一种简单、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)分子检测方法,基于ASFV P72基因保守序列,设计并合成引物,建立了一种ASFV重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,所建立的RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应30 min,即可实现对目的片段的有效扩增;以包含ASFV P72基因的ORF质粒为模板,RPA的检测限达到10~2 copies,同世界动物卫生组织(OIE)推荐的实时荧光PCR方法检测限一致,但比OIE推荐方法的检测限高10倍;RPA仅特异性扩增ASFV P72基因,对FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组c DNA或DNA没有扩增。本研究所建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低、结果确实可靠,为非洲猪瘟的一线防控提供了一种新的、可靠的技术支持。 相似文献
12.
为实现对牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速检测和分型,本试验根据GenBank已发表的BVDV1和BVDV2 5′UTR基因特异性保守区域设计特异性引物和探针,以体外转录病毒RNA作为模板,建立了BVDV1和BVDV2一步法双重荧光RT-PCR方法。结果显示,双重荧光RT-PCR对BVDV1和BVDV2的检测下限均为102拷贝;具有较强的特异性,对口蹄疫病毒、猪瘟病毒、Hobi样病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、施马伦贝格病毒等病毒核酸的扩增均为阴性;BVDV1和BVDV2的扩增均在102~107拷贝内呈现良好的线性关系,标准曲线的相关系数(R2)分别为0.999和0.998;方法重复性好,BVDV1和BVDV2的变异系数(CV值)分别在0.68%~1.87%和1.25%~1.90%。本试验对665份样品进行检测,共检出BVDV阳性样品45份,其中BVDV1阳性样品39份,BVDV2阳性样品5份,BVDV1和BVDV2均阳性样品1份。结果表明,本试验建立的BVDV一步法双重荧光RTPCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,可广泛应用于BVDV的快速检测、分型和流行病学调查。 相似文献
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为实现牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)精准的定量检测，以IBRV gB基因为靶基因，建立IBRV微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量检测方法，进行了ddPCR退火温度、引物和探针浓度的优化、特异性和灵敏性试验。结果显示，建立的ddPCR方法最佳退火温度为56.5℃;反应体系中最佳引物、探针浓度分别为900和250 nmol/L;能够实现IBRV的特异性检测，与其他常见的牛呼吸系统疫病病原无交叉反应；以重组质粒pMD19-T-gB为模板，ddPCR方法的检出限为1.8 copies/μL,是实时荧光PCR方法敏感性的10倍。对119份具有呼吸道症状的牛鼻拭子样本分别进行ddPCR方法和实时荧光PCR方法进行检测，结果显示，ddPCR方法和实时荧光PCR方法的检出率分别为(15.13%,18/119)和(12.60%,15/119)。本研究建立的ddPCR方法特异性强、灵敏度高，可作为牛呼吸道临床样品中IBRV精准定量检测的有效手段。 相似文献