非洲猪瘟病毒一步法巢式锁核酸荧光定量PCR方法的建立     

施科达  徐民生  李艳  张昆丽  翟少伦  勾红潮  宋帅  杨冬霞  臧莹安  孙铭飞  李春玲 《中国农学通报》2023,(11):143-151

试验基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)B646L(P72)蛋白基因序列，建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。采用Oligo 7软件设计一步法巢式锁核酸荧光定量PCR(One Step NestedLocked Nucleic Acid real-time PCR,LNA-OSN-PCR)的嵌套引物以及探针，并对外引物进行锁核酸修饰。建立并优化LNA-OSN-PCR反应体系和条件，确立LNA-OSN-PCR标准曲线，并检验LNA-OSN-PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。采用LNA-OSN-PCR方法，对96份临床疑似患病样品进行检测，同时与普通荧光探针PCR方法进行比较。试验确立并优化了LNA-OSN-PCR的反应条件和体系，建立的LNA-OSN-PCR标准曲线，具有较好的线性(R²=0.9945)。该方法的最低检测限为3×10^-1copies/μL，变异系数小于3%，并且与其他病毒或细菌核酸无交叉反应。LNA-OSN-PCR方法与OIE推荐的荧光定量PCR方法比较，检测灵敏度提高10～100...  相似文献   

MLKL基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响     

谢思豪  勾红潮  卞志标  李斌  蔡汝健  臧莹安  李春玲 《中国畜牧兽医》2022,49(5):1934-1941

【目的】 构建混合谱系激酶结构域样(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)基因敲除的PK-15细胞株(PK-15 MLKL-KO)，研究敲除MLKL基因对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)复制的影响。【方法】 根据MLKL序列设计特异性编辑位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MLKL-sgRNA编辑载体，转染至PK-15细胞，经嘌呤霉素药物筛选获得多克隆细胞系，通过有限稀释法获得PK-15 MLKL-KO单克隆细胞株。通过靶基因组PCR、测序和Western blotting验证MLKL基因在PK-15细胞上的敲除水平;采用Reed-Muench法检测病毒增殖水平;采用PI染色和荧光显微镜观察细胞坏死情况。【结果】 试验成功构建MLKL-sgRNA载体，筛选出1株MLKL基因缺失647 bp的PK-15细胞株，Western blotting未检测到MLKL蛋白的表达。与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞极显著或显著提高了PRV GD-WH(感染后36 h除外)和PRV Bartha-K61的病毒滴度(P<0.01;P<0.05)。PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO细胞后，坏死细胞明显减少。【结论】 本研究构建了MLKL基因敲除的PK-15细胞株，与PK-15细胞相比，PK-15 MLKL-KO细胞显著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的复制和存活能力，为PRV Bartha-K61疫苗生产过程中提高病毒产量提供了一种可行性策略。  相似文献   

猪链球菌临床分离株对四环素类抗生素的耐药性和耐药基因分析     

刘宝玲  楚品品  李春玲  杨冬霞  蒋智勇  张昆丽  宋帅  勾红潮  蔡汝健 《中国畜牧兽医》2022,49(7):2796-2804

【目的】了解广东地区猪链球菌（Streptococcus suis，S.suis）临床分离株对四环素类抗生素的耐药性及耐药基因携带情况。【方法】采用药敏纸片扩散法对2016－2020年分离自广东地区的34株猪链球菌进行四环素类抗生素耐药分析，并通过PCR方法检测四环素耐药基因tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX携带情况。【结果】34株猪链球菌对四环素的耐药率高达100%（34/34），其次为米诺环素82.4%（28/34）、多西环素47.1%（16/34）。34株猪链球菌中3重耐药菌株有15株，占比44.1%（15/34），2重耐药菌株有14株，占比41.1%（14/34），耐1种药物的菌株5株，占比14.7%（5/34）。耐药基因检测结果显示，tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX基因携带率分别为0、0、0、14.7%（5/34）、100%（34/34）和0。【结论】广东地区猪链球菌临床分离株四环素类抗生素的耐药率较高，主要携带的四环素耐药基因为tetO和tetM基因。  相似文献   

民勤温性荒漠草原拟步甲昆虫多样性调查     

他富源  张弘扬  勾文山  马维新  胡桂馨 《干旱区研究》2023,(5):840-848

为明确民勤温性荒漠草原拟步甲昆虫群落多样性及其时间动态，于2021年4—10月采用巴氏罐诱法对甘肃省民勤县砾质、沙质与盐土荒漠草地拟步甲科昆虫群落进行系统调查。（1）本次调查共捕获拟步甲科昆虫8492头，分属于8属10种，其中姬小胸鳖甲（Microdera elegans）和多毛宽漠甲（Sternoplax setosa setosa）为优势种，分别占总个体数的26.88%和25.07%，波氏真土甲（Eumylada potanini）为砾质荒漠草地的特有种。（2）3个亚类荒漠草地拟步甲昆虫物种数和个体数在7月达到峰值，10月降到最低。（3）砾质荒漠草地和沙质荒漠草地的拟步甲群落多度和香农多样性指数显著高于盐土荒漠草地（P<0.05）；盐土荒漠草地的拟步甲群落丰富度显著高于沙质荒漠草地（P<0.05）。（4）相关性分析表明，拟步甲群落的丰度指数与植被群落高度、土壤含水量和植被盖度呈显著负相关（P<0.05）；拟步甲丰度指数与植被香农多样性指数和植被丰富度呈显著正相关（P<0.05）。荒漠草原的植被组成单一，促使拟步甲群落组成简单；相对于盐土荒漠草地和沙质荒漠草地...  相似文献   

猪增生性肠炎的诊治     

徐民生  柯海意  杨冬霞  宋帅  勾红潮  张昆丽  蒋智勇  李艳  楚品品  翟少伦  简运华  李春玲 《广东畜牧兽医科技》2023,(1):35-38

广东省某规模化养猪场部分圈舍猪群发生腹泻、拉血便症状，病理解剖显示肠道组织肿大出血，死亡猪只粪便呈黑色煤焦油状。本文采集了病死猪只的粪便进行PCR检测和鉴定，结合发病症状，确定发病原因是由于胞内劳森菌引起的猪增生性肠炎。用药物泰妙菌素进行临床治疗，结合其他药物辅助治疗，猪群健康状况逐渐趋于稳定。  相似文献