实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgM mRNA方法的建立   总被引：1，自引：0，他引：1  

韦木莲  刘春  梁慧丽  李凯彬  石存斌  吴淑勤 《广东农业科学》2010,37(6):185-187,202

建立了SYBR greenⅡ实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgMmRNA水平的方法,即构建鲫鱼IgM标准品质粒,10倍稀释质粒标准品,建立标准曲线,进行熔解曲线分析和稳定性分析。结果表明,Ct值线性范围为5.8～25.4,相关系数为1;熔解曲线峰值单一,Tm为85.62(±0.13)℃;组内变异系数CV为0.18%～1.07%,组间变异系数为0.31%～2.31%。该方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。  相似文献   

用Protein A亲和层析法快速分离纯化鲫血清IgM方法的建立和应用     

吴光辉  王庆  巩华  石存斌  李华  吴淑勤 《大连水产学院学报》2010,25(3):233-237

采用Protein A亲和层析法对鲫Carassius auratus血清中的IgM进行快速分离纯化,所得产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western blotting）进行分析检测。结果表明：采用Protein A亲和层析法可以很好地分离到高纯度的鲫血清IgM,电泳条带中重链和轻链清晰可辨,重链、轻链的相对分子质量分别为85 000、25 000左右,无明显杂带;利用纯化的鲫血清IgM免疫小鼠,获得了高效价抗IgM抗血清,可以特异性识别鲫血清和黏液中IgM重链。应用间接ELISA方法对浸泡免疫后的鲫血清和皮肤黏液中抗体的动态进行检测,结果显示：鲫皮肤黏液中的抗体滴度在免疫后第6天达到峰值,血清中抗体滴度在免疫后第15天达到峰值,前者高峰期出现较早,但持续时间短,后者高峰期出现较晚,但持续时间较长。本试验中所建立的Protien A亲和层析法为鱼类抗体制备、病原检测及免疫学相关研究提供了一种便捷的方法。  相似文献   

实时荧光定量RT-PCR检测剑尾鱼IgM mRNA方法的建立     

张铃铃  任艳  石存斌  吴淑勤 《大连水产学院学报》2010,25(2):172-177

根据剑尾鱼Xiphophorus helleri IgM和β-actin基因序列,分别在保守区域设计并合成引物,从注射免疫后的剑尾鱼头肾中提取总RNA逆转录合成cDNA,对目的片段进行PCR扩增、电泳纯化、T-A克隆及测序鉴定。将所得标准品质粒以10倍梯度进行稀释,采用SYBR Green I染料进行荧光定量扩增,构建标准曲线并进行融解曲线分析。结果表明：构建的剑尾鱼IgM和β-actin基因的标准品Ct值检测范围分别为7~21和8~25,扩增效率分别为2.025、1.970;融解曲线分析结果显示具有特异的单个峰,其Tm值分别为82.43℃、86.09℃,表明扩增产物特异性非常好。本实验中建立的剑尾鱼IgM基因实时荧光定量PCR方法可用于对剑尾鱼IgM基因的转录水平进行测定。  相似文献   

一株鳢科鱼源弹状病毒的分离及鉴定   总被引：3，自引：3，他引：0  

曾伟伟  王庆  王英英  刘春  谭爱萍  石存斌  吴淑勤 《水产学报》2013,37(9):1416-1424

为研究近来鳢科鱼类疫病频发的病因,实验对采集的患病杂交鳢病料分别从细菌学和病毒学两方面进行病原分离和鉴定。排除细菌感染的可能后,通过细胞培养技术、回归感染实验、电镜技术、分子生物学技术等进行病毒学分析,最终分离到一株弹状病毒,命名为HSHRV-C1207(Hybrid Snakehead Rhabdovirus-C1207)。实验结果显示,该病毒在EPC、FHM、GSB、SFC、CIK等 8种细胞中都能复制,并对其中6种细胞产生明显的细胞病变效应(CPE)。用分离的病毒进行回归感染实验,可使感染的杂交鳢复制出自然发病鱼的相同症状,且死亡率达90%。感染病料组织液的EPC细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量子弹状病毒聚集,直径约60 nm,长度约为160 nm,形态和排列方式与已报道的鱼类弹状病毒相似。参考OIE中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的检测引物及根据乌鳢弹状病毒(SHRV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、比目鱼弹状病毒(HIRRV)的G蛋白基因设计特异性引物,分别对自然发病病料组织、接种病料组织的细胞进行RT-PCR扩增,仅针对SCRV的引物能扩增出大小约350 bp 的片段。对HSHRV-C1207株的G基因进行序列测定和分析,结果表明其核苷酸序列同SCRV和SHRV的同源性分别为93.8% 和 20.4%,推导的氨基酸序列同源性分别是93.7%和18.3%。用G基因推导氨基酸序列与其它弹状病毒的G蛋白进行系统进化树分析,表明该毒株与水泡性病毒属聚为一支,其中与SCRV的亲缘关系最近,而与属于诺拉弹状病毒属的SHRV相距甚远,可能为SCRV的变异株或一个新的毒株。  相似文献   

鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕的构建及制备条件优化   总被引：1，自引：1，他引：0  

李宁求  余露军  付小哲  刘礼辉  林强  常藕琴  石存斌  黄志斌  吴淑勤 《水产学报》2012,36(11):1754-1762

菌蜕具有完整细菌表面抗原结构, 可诱导机体的体液和细胞免疫应答, 成为疫苗制备的候选之一,为了探讨鳗鲡迟缓爱德华氏菌菌蜕疫苗的可行性, 实验采用基因重组技术构建了噬菌体PhiX174裂解酶基因(Lysis E)的温控表达载体, 转化迟缓爱德华氏菌, 成功制备其菌蜕, 并对菌蜕形态、溶菌动力学、裂解效率以及制备条件等进行了研究。结果表明, 细菌菌蜕表面形成溶菌孔道, 细胞因内容物流失而发生明显的皱缩; 构建的迟缓爱德华氏菌诱导后1 h开始裂解, 5 h后裂解基本完成, 裂解效率为99.99%, 冷冻干燥后重悬涂布平板, 未检出活菌, 电镜观察表明冻干前后细胞形态未见明显变化; 构建的迟缓爱德华氏菌分别在OD₆₀₀值为0.4和0.6进行诱导, 其裂解过程和裂解效率没有明显区别; 分别用LB、BHI、NB 3种培养基进行比较研究, 其中LB培养基制备的菌蜕细胞较完整、裂解完全, 是制备迟缓爱德华氏菌菌蜕最优培养基。本研究成功构建了鳗源迟缓爱德华氏菌菌蜕, 并对其制备条件进行了优化, 为鳗鲡爱德华氏菌病疫苗开发奠定了基础。  相似文献   

草鱼出血病发生风险半定量评估模型的构建   总被引：1，自引：1，他引：0  

杨淞  吴淑勤  李宁求  石存斌  邓国成  林文辉  林强 《中国水产科学》2012,19(3):521-527

本研究通过调查、分析草鱼出血病发生的各种风险因素,初步构建该病发生的风险评估模型,旨在为防控疾病提供决策依据。该模型包括由层次分析法构建的指标体系,以德菲尔法确定的各风险因素权重,由综合评价法表述的风险评估结果。构建的草鱼出血病风险指标体系包括9个目标层,即鱼种(B1)、免疫(B2)、水质(B3)、放养密度(B4)、水温(B5)、饲养管理(B6)、发病史(B7)、天气(B8)、池塘状况(B9);26个风险指标层,主要包括如鱼种是否带毒(C1)、是否免疫(C4)、免疫时健康状况(C6)、放养密度(C13)、水温(C14)、近年来发病情况(C19)等。目标层风险因素权重值集合为W={0.167;0.202;0.124;0.109;0.101;0.097;0.092;0.081;0.064},其中免疫和鱼种权重值最高。采用综合评价法表示风险评估结果,其函数模型为,ij ij得出华中地区、西南地区和华南地区发生草鱼出血病的风险值分别是0.699、0.690、0.568,与实际调查结果相符,即采取免疫接种措施后华南地区发生草鱼出血病的风险较华中和西南地区低。  相似文献   

杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)内脏类结节病病原菌的分离、鉴定与特性分析     

刘春  李凯彬  王庆  常藕琴  梁慧丽  王芳  潘德博  石存斌  吴淑勤 《水产学报》2012,36(7):1119-1125

从广东佛山、广州两地养殖场患内脏类结节病杂交鳢(Channa maculata♀×C.argus♂)内脏器官分离到2株细菌,纯化培养后获得2个分离株,编号为WL-1和WL-2,对分离菌株进行了细菌鉴定、致病性分析及药敏实验。应用常规生理生化鉴定和ATB系统细菌自动鉴定仪对分离菌株进行细胞形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为舒伯特气单胞菌。采用16S rRNA基因、DNA促旋酶的B亚单位蛋白(gyrB)基因对分离菌株进行DNA分子鉴定,结果显示,两个菌株间的16S rRNA基因序列相同,gyrB基因序列同源性为99.7%;分离菌株与GenBank上登录的舒伯特气单胞菌16S rRNA基因序列和gyrB基因序列同源性均最高,达99%以上;分离菌株在系统进化树上与舒伯特气单胞菌聚为一族,进一步确认分离株为舒伯特气单胞菌。人工感染健康鱼后出现与自然发病相似的内脏类结节病症状,从发病鱼内脏组织再分离的细菌特性与原感染菌相同。综合理化特性分析、基因鉴定和人工感染实验确认舒伯特气单胞菌是杂交鳢内脏类结节病的致病菌。药敏实验发现分离菌株对头孢唑啉、庆大霉素等14种药物敏感;对青霉素G、苯唑西林2种药物耐受。  相似文献   

3月龄草鱼种免疫器官组织学及其免疫后免疫基因的转录差异     

张鹏英  常藕琴  石存斌  吴淑勤 《淡水渔业》2016,(6):64-70

为研究处于同一时期但养殖条件不同的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鱼体规格与发育状态间是否具有一致性,观察压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏的显微结构,并对压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼进行腹腔注射疫苗处理,实时荧光定量PCR检测免疫7 d后、14 d后各期草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM与MHCⅠ的表达量。结果显示,压塘3月龄草鱼各组织发育较普通3月龄草鱼迟缓。压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼在免疫后,头肾、中肾、肠道与脾脏中IgM和MHCⅠ的表达量均有上升,且IgM与MHCⅠ的相对表达量峰值均出现在普通3月龄草鱼免疫14 d后的中肾中(IgM为74.51倍;MHCⅠ为56.02倍。结果表明,草鱼出血病活疫苗可以增强草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM和MHCⅠ的表达,且在3月龄时期进行注射免疫效果最佳。  相似文献   

剑尾鱼感染嗜水气单胞菌的动态病理变化观察   总被引：12，自引：0，他引：12  

杜雄伟于博  李叶常藕琴  吴淑勤石存斌 《中国兽医科技》2004,34(10):22-25

对剑尾鱼感染嗜水气单胞菌的病理变化进行了全面细致的观察。结果显示：剑尾鱼感染发病呈急性过程，感染后10～15h为发病死亡高峰期；病理组织学变化以全身溶血性贫血和广泛的组织细胞变性、坏死为主；感染发病死亡时间主要集中在5～24h，感染部位和鳃最先受到损伤，最终因各器官结构破坏、功能衰竭和窒息而亡。  相似文献   

剑尾鱼肝脏cDNA文库的构建   总被引：2，自引：0，他引：2  

刘坡  李凯彬  王芳  刘春  聂湘平  吴淑勤 《中国水产科学》2009,4(4)

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