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依据GenBank登录的鸭肠炎病毒(DEV)核苷酸序列设计引物,利用长片段PCR技术扩增了DEV基因组UL36与UL43基因之间的未知序列,扩增所得片段长度约为15 kb.经EcoRV单酶切,将其中的3.9 kb片段克隆到pUC18中.序列分析表明该3.9 kb EcoR V片段含有2个完整的转录方向相反的与单纯疱疹病毒(HSV)UL41和UL42基因同源的ORF,命名为DEV UL41和ULA2基因.通过氨基酸序列比对发现:DEV UL41基因含有5个高度保守位点,而UL42含有2个,进化树分析表明DEV与疱疹病毒科a疱疹病毒亚科的马立克病毒、火鸡疱疹病毒的进化关系非常相近,为DEV的分类提供了参考依据. 相似文献
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SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法检测禽流感病毒 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立检测禽流感病毒（AIV）的SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR方法，根据AIV的M基因保守区的核苷酸序列设计引物。用4株不同亚型的AIV感染MDCK细胞，收集感染6、12、24、48、72h的病毒。另外采取169份鸡的泄殖腔拭子和咽喉拭子。对上述样品的M基因进行检测，试图建立快速检测AIV的SYBR GreenⅠ荧光RT—PCR方法，并与普通RT—PCR方法和传统的病毒滴定方法进行比较。结果表明：此次建立的检测AIV的SYBR GreenⅠ荧光RT-PCR方法能检测到感染MDCK细胞后72h的AIV，对169份泄殖腔拭子和咽喉拭子中的AIV检出率为5．33％（9／169），而普通RT—PCR方法检出率为6．51％（11／169），病毒滴定检出率为5．62（9／160）。对其他病毒（NDV、IBDV、IBV、VA）则未检测到，且整个检测过程只需4h，表明该方法特异、准确、快速。 相似文献
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禽流感病毒N1和N2亚型神经氨酸酶RT-PCR鉴别方法的建立 总被引：8，自引：1，他引：7
针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的禽流感病毒(AIV)N1、N2亚型神经氨酸酶基因设计了2对引物，建立了一种RT—PCR鉴别方法，其目的片段大小分别为358bp、377bp。经对A／goose／Guangdong／1／96(H5N1)、A／Turkey／England／N28／73(H5N2)、A／African starling／983／79(H7N1)和A／Turkey／Wiscosin／1／66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液样品进行扩增，扩增片段的大小与预期大小完全相符。经对国内不同地区分离的16株AIV N1亚型和21株AIV N2亚型用RT-PCR方法检测，阳性检出率分别为87．5％(14／16)和95．2%(20／21)；对50份样品进行盲检，准确率为98％(49／50)。 相似文献
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为研究鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因组异构体的存在形式,本研究在已建立的以pCC1FOS为载体的DEV疫苗株基因文库基础上对DEV全序列进行了测定,并进一步对DEV基因组的异构体进行了研究。对261个重组fosmid中的DEV基因组片段的末端序列进行测序及序列分析,初步证明了DEV基因组有3种异构体,即P型、IS型和ILS型,未发现IL型的存在。并且,以上3种异构体在基因组中所占比例分别为77.1%、8.6%和14.3%。通过对11个重组fosmid的全序列测定,进一步确认了以上3种异构体的存在。该结果为DEV的分类提供了重要实验依据。 相似文献
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为研究禽流感病毒(AIV)DNA疫苗重组质粒在组织中的分布情况,本研究以AIV DNA疫苗pCAGGoptiHA 5HA基因为检测对象,分别建立检测AIV DNA疫苗重组质粒的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法和TaqMan MGB实时定量PCR方法。经优化比较两种方法的特异性、敏感性、重复性和污染率。结果表明,两种方法的标准曲线线性关系均较好,相关系数均达到0.999;最低检测量为42 copies,特异性强;探针法的重复性优于染料法,污染率低于染料法,因此采用TaqMan MGB实时定量PCR方法检测AIV DNA疫苗重组质粒组织分布情况。 相似文献
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为评价H5亚型禽流感病毒(AIV)DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭的免疫保护效力,本研究将pCAGGoptiHA5以20μg、30μg和50μg剂量免疫3周龄SPF鸭,首次免疫后3周加强免疫一次。2周后以105EID50的鸭源高致病力AIV由鼻腔攻毒,观察SPF鸭发病和死亡情况。分别于攻毒后3d、5d和7d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离,检测鸭排毒情况及免疫和攻毒后血凝抑制(HI)抗体、中和(NT)抗体的动态变化。结果表明:30μg和50μg免疫组均可对免疫鸭产生100%保护,而20μg剂量组则可对免疫鸭提供80%保护。 相似文献
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为验证一株禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)中的3条T细胞表位候选肽NP89-97(PKKTGGPIY)、NP198-206(KRGINDRNF)和NP64-71(ERMVLSAF)的免疫原性,本研究构建了含有NP基因的重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,间接免疫荧光和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得表达.重组质粒免疫鸡后,用间接酶联免疫实验检测发现重组质粒在鸡体内能诱导产生相应的抗体.将多肽NP89-97、NP198-206、NP64-71和不相关肽N71-78(WRRQARYK)在体外刺激免疫后鸡的脾淋巴细胞,流式细胞术检测发现CD8+T淋巴细胞增殖分别为13.7%、11.9%、0.6%和0.4%;ELISA检测结果显示多肽NP89-97、NP198-206刺激后的淋巴细胞中IFN-γ的分泌量明显增加.本实验表明多肽NP89-97和NP198-206能在体外诱导活化的鸡淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞反应,为AIV NP的T 细胞表位.该研究结果对研究禽类抗流感病毒的免疫机制及抗流感疫苗具有重要的意义. 相似文献
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为建立通用型禽流感病毒(AIV)快速检测方法,本研究将合成的同义NP (ConsNP)基因克隆于pET30a中,利用大肠杆菌系统进行原核表达,以纯化重组ConsNP蛋白作为包被抗原,建立了检测AIVNP抗体的间接ConsNP-ELISA方法,并优化了反应条件.结果表明:抗原包被量为1μg/孔;封闭剂为5％脱脂乳;一抗血清稀释度为1∶200; HRP标记的兔抗鸡IgG(酶标二抗)稀释度为1∶20 000;阴阳性临界值为:OD49nm值＞0.239.该间接ELISA方法与其他亚型AIV阳性血清均呈阳性反应,与新城疫病毒,马力克病病毒,禽传染性囊病病毒阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性.本研究为进一步研制通用型的禽流感ConsNP-ELISA检测试剂盒奠定了基础. 相似文献