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大豆锌指转录因子GmDi19-5对高温的响应及互作蛋白的筛选 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基因拟南芥在高温处理下进行的组织化学染色,分析Gm Di19-5启动子在高温胁迫下的活性;构建p GBKT7-Gm Di19-5诱饵载体,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵筛选大豆c DNA文库,筛选与其互作的候选蛋白;进一步用酵母双杂交系统验证Gm Di19-5与候选蛋白的互作;利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白基因在对高温处理的响应情况;构建融合表达载体,用GFP-Gm Di19-5融合表达载体转化拟南芥原生质体,检测Gm Di19-5蛋白的亚细胞定位情况。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,Gm Di19-5在高温胁迫下上调表达;启动子元件分析表明,Gm Di19-5包含多种与胁迫应答相关的顺式作用元件,包括热响应元件HSE;组织化学染色分析发现,经高温处理后,过表达拟南芥幼苗的地上部分和地下部分均有报告基因的表达;亚细胞定位结果表明,Gm Di19-5蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核中;通过酵母双杂交技术筛选到了与Gm Di19-5互作的候选蛋白,试验进一步验证了Gm Di19-5与Gm Dna J在酵母细胞中互作;另外,实时荧光定量PCR结果显示,互作蛋白基因Gm Dna J受高温胁迫诱导表达。【结论】Gm Di19-5受高温诱导表达,Gm Di19-5可能与Gm Dna J互作,表明Gm Di19-5功能的发挥可能需要Gm Dna J的参与。 相似文献
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COR家族成员在调控植物响应低温胁迫过程中发挥重要作用。从拟南芥中克隆一个新的低温胁迫响应基因At CP2,其属于COR基因家族中的COR413亚家族,编码区612 bp,编码203个氨基酸,分子量22.75k Da,等电点9.44。亚细胞定位和基因表达模式分析结果表明:At CP2定位在叶绿体膜上,对ABA、PEG、Na Cl和低温四种非生物胁迫均有响应。基因功能分析结果显示:功能缺失性突变体cp2冷处理后存活率明显高于野生型拟南芥(WT),相对电导率和MAD均低于WT,证明At CP2基因负向调控植物抗冻性。蛋白质组及qRT-PCR分析结果证明At CP2通过负向调控4个ABA及低温胁迫相关基因(包括ABA2、KIN1、COR47和COR15B)的表达影响植物抗冻性。总之,At CP2基因的功能分析结果对了解COR413基因家族的功能提供了参考。 相似文献
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普通小麦5DL染色体分选及染色体BIBAC文库构建技术体系优化 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】优化小麦染色体流式分选及特定染色体BAC文库构建技术体系,为加速小麦基因组学研究提供技术支撑。【方法】采用双阻断法对中国春5DL端体根尖分生组织进行细胞周期同步化处理,结合机械匀浆法制备染色体悬浮液进行流式核型分析,分选染色体5DL及PCR检测,对小麦染色体分选技术体系进行优化。对复合峰分选产物Bam HI酶切制备高分子量（high molecular weight,HMW）DNA,按10﹕1质量比与双元细菌人工染色体（binary-bacterial artificial chromosome,BIBAC）连接,电激转化感受态细胞DH10B,随机挑取100个重组子,经NotI完全酶切后脉冲电泳检测插入片段大小,优化小麦染色体BAC文库构建的技术体系。【结果】经1.25 mmol•L-1 羟基脲（hydroxyurea,HU）18 h,恢复6 h和1 µmol•L-1 氟乐灵（trifluralin）2.5 h的顺序处理的小麦根尖分生组织,细胞有丝分裂指数可超过60%。流式核型分析表明,5DL端体的流式核型图由清晰的三个复合峰和两个单峰组成。PCR鉴定表明,其中一单峰确由5DL染色体组成。部分酶切复合峰染色体3～10 min,可以获得50～300 kb 的HMW DNA。连接产物检测显示平均插入片段可达100 kb左右,根据荧光通道值,估算5DL端体的大小约为482 Mb,构建库容为19 000个克隆的5DL端体特异文库即可达到约4倍的覆盖率。【结论】上述两项优化技术适用于小麦染色体的分选及染色体特异文库的构建。 相似文献
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小麦ERF类转录因子W17的结合特异性及亚细胞定位分析 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】构建ERF（ethylene-responsive element binding factor）转录因子基因W17的亚细胞定位载体和原核表达载体,验证W17是否具有核定位功能,阐明W17与GCC、DRE探针的体外结合特性,利用GUS瞬时表达系统分析W17蛋白的体内结合特性和转录激活功能,初步预测W17在植物胁迫信号传导途径中的作用。【方法】构建W17/163hGFP亚细胞定位载体,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24 h后共聚焦显微镜下观察。构建W17/pGEX-4T-1原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG（0.5 mmol•L-1,3 h）诱导,GST纯化柱纯化,纯化的融合蛋白与[γ-32P]ATP标记的GCC、DRE探针混合进行凝胶阻滞试验。构建GUS瞬时表达系统,通过农杆菌介导转化烟草,X-Gluc染色、酒精脱色后体视显微镜下观察。【结果】W17基因具有核定位功能,纯化的融合蛋白GST/W17能与正常GCC、DRE探针体外特异结合,与突变GCC、DRE探针不结合,在植物体内与GCC特异结合并能激活下游GUS基因表达。【结论】W17通过自身的NLS进入核内行使功能,参与了GCC-box调控的生物胁迫信号传导途径,还可能参与了非生物胁迫（盐胁迫）传导途径。 相似文献
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将多个不同的抗病亲本及优良农艺亲本进行复合杂交,选育出抗病且农艺性状较好的小麦新品系观4.为了明确观4的抗病性及品质状况,对该品系的抗病基因及品质性状进行分子标记鉴定和分析.结果表明,观4兼抗白粉病和条锈病,其白粉病抗性主要来自亲本92R179中的Pm21基因,而条锈病抗性则主要源于YW243中的抗条锈病基因YrX;辽春10号中的高分子量麦谷蛋白优质亚基7+8也遗传到新品系观4中.因此,观4可作为优良小麦亲本应用于小麦品质和白粉病、条锈病抗性的改良. 相似文献
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体细胞胚胎发生类受体激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERK）与植物体细胞胚发生，尤其是与植物非生物逆境胁迫响应有关。为鉴定甘蓝型油菜中BnaSERK基因家族成员、揭示其进化关系及其与油菜盐/旱胁迫的响应，利用生物信息学方法对甘蓝型油菜品种中双11的SERK家族成员、基因结构、进化关系、选择压力等进行系统分析，并初步分析了部分BnaSERK基因在盐/旱胁迫下的表达响应模式。结果表明：在甘蓝型油菜基因组共鉴定到24个BnaSERK基因，它们不均等地分布在15条染色体上，可分为3个亚族，具有相对保守的基因结构和保守基序，且含多种与激素和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。共线性分析表明，甘蓝型油菜和拟南芥、白菜、甘蓝分别有14对、44对和32对基因表现出共线性。基于比较基因组学研究，甘蓝型油菜BnaSERK基因在经历多倍体化之后，出现了不同程度的丢失现象。分析表明，BnaSERK基因家族在芸薹属物种间的进化相对保守。盐/旱胁迫下的5个BnaSERK基因在叶片中的表达模式分析结果显示，BnaA07g29610D、BnaC01g43240D、BnaCnng07810D基因在盐胁迫下表达量上调，而BnaA01g23070D、BnaA07g23390D基因则表现为下调；BnaA07g23390D、BnaA07g29610D基因在干旱胁迫下表现为上调表达，而BnaC01g43240D、BnaCnng07810D、BnaA01g23070D基因呈下调趋势。表明BnaSERK基因可能在油菜响应盐/旱胁迫的调控机制中发挥着重要作用。 相似文献
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以两个转W16基因小麦株系及相应的受体对照品种为材料,在大田控水的条件下研究了水分胁迫对转基因小麦抽穗期相关生理特性的影响,利用方差分析方法对转基因株系的抗旱性进行了综合评价.结果表明:转基因株系和对照及受体有着较大的差异,随着水分胁迫的加剧,参试品种的相对含水量、气孔导度、光合速率、叶绿素含量呈下降趋势,转基因小麦的下降幅度较小;丙二醛含量、胞间CO2浓度、质膜相对透性呈上升趋势.受体对照品种的上升幅度大于转基因小麦;转基因小麦的脯氨酸含量显著高于对照品种.方差分析表明,转基因小麦株系G19-X51、G19-X61具有较好的抗旱性. 相似文献
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以拟南芥AVP1为诱饵,采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB。酵母互作试验表明,AVP1和AtRAB存在互作;双分子荧光互补实验(BiFC)证明,AVP1和AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、AtRAB和AVP1的拟南芥突变体rab和avp1在高盐胁迫条件下,随着NaCl浓度的加大,突变体rab和avp1的表型变化相似,相对于WT都表现为根长缩短,侧根数减少;在低磷处理条件下,随着磷浓度的逐渐降低,2个突变体的表型相似,相对于WT同样表现为根长缩短,总根面积减少,侧根数减少;在相同磷浓度条件下,突变体rab对胁迫的反应比avp1强;在低钾处理条件下,随着钾浓度的降低,2个突变体的表型与在低磷胁迫处理条件下的表型相似。结果说明,AVP1和AtRAB可以在细胞膜和细胞核上相互作用,AtRAB能够影响植物对离子的吸收,AVP1和AtRAB的突变体在高盐、低磷和低钾等胁迫条件下表型变化相似,证明了2个基因都正向调控植物对高盐、低磷和低钾胁迫的反应,它们属于同一信号途径。 相似文献
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构建染色体特异文库是简化小麦基因组测序的有效途径,而通过同步化处理提高根尖细胞有丝分裂指数,使根尖细胞中富集高比例的中期染色体是实现染色体分选成功的前提。采用双阻断法用50 µmol L-1羟基脲和100 µmol L-1氟乐灵对普通小麦根尖细胞进行同步化处理,然后用流式核型分析法观测各周期细胞在不同时间点上的比例变化。结果显示,最佳方案为羟基脲处理10 h,恢复7 h,氟乐灵处理4 h。以此方案处理中国春小麦根尖可获得最高的有丝分裂指数,达70.1%。附加冰水处理(0°C)有助于减少染色体碎片和增加流式核型的分辨率,但对富集更多的中期染色体没有效果。 相似文献