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采用RT-PCR获得BALB/c小鼠P41基因,并在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461 nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变；然后采用定向克隆方法将狂犬病病毒糖蛋白主要中和抗原表位核苷酸序列替换P41序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应以获得带有Kozak调控序列的P41-N分子,以增加目的基因的表达量,并将该含有Kozak序列的P41-N分子克隆插入到真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定；最后将各中和表位表达载体转染COS-7细胞,Western blotting检测目的基因的瞬时表达.测序分析结果显示,BALB/c小鼠P41基因CDS区为840 bp,编码279个氨基酸,与GenBank已登录(NM_010545)核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异；定点突变后获得了P41分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明成功构建了携带P41-N分子的真核表达载体；Western blotting证实各P41-N分子均在COS-7细胞获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P41多克隆抗体发生抗原抗体结合反应.结果表明,成功构建了狂犬病病毒主要中和抗原表位的“靶向性”核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础. 相似文献
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采用PCR技术，从大肠杆菌K99中扩增出0．54kb的K99菌毛抗原基因，然后将其克隆到pUCm—T载体上，用Bgl Ⅱ鉴定K99插入的方向并测序。选择目的基因片段插入方向正确的重组质粒经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，通过T4连接酶与同样经BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切合成的耐热肠毒素ST Ⅰ核苷酸序列连接，通过PCR方法鉴定分析和核苷酸序列测序分析，证明插入的K99-ST Ⅰ融合基因片段具有正确的核苷酸序列。 相似文献
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为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit, CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R2=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。 相似文献
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为了建立快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪肺炎支原体(Mhp)的双重荧光PCR检测方法，本试验根据NCBI数据库中的PRRSV ORF7和Mhp P36基因，分别设计引物和TaqMan探针，通过优化扩增反应条件，建立PRRSV和Mhp的双重荧光PCR检测方法；分析所建立PCR方法的特异性、敏感性和重复性，并初步应用于临床样品检测。结果显示，25μL PCR反应体系中各引物最佳添加量：PRRSV-F 1.5μL、PRRSV-R 1.0μL、PRRSV-P 0.8μL、Mhp-F 1.2μL、Mhp-R 1.3μL、Mhp-P 0.7μL。优化后的PCR反应程序：50℃反转录20 min, 95℃预变性2 min, 95℃变性5 s, 55℃退火10 s, 72℃延伸20 s (此处收集荧光),40个循环。建立的双重荧光PCR方法特异性较好，与其他猪常见病原体无交叉反应；检测PRRSV和Mhp的敏感性分别为4.2拷贝/μL和9.6拷贝/μL;批内和批间变异系数均不高于2%,具有很好的重复性。因此，本试验建立的双重荧光PCR方法可同时检测PRRSV和Mhp,为猪繁殖与呼吸综合征... 相似文献