H5N1亚型禽流感病毒HA部分基因的克隆与可溶性表达     

庞学敏  郭伟伟  李明义  黄保续 《中国动物检疫》2010,27(3):36-38,46

本研究根据Genbank中记录的禽流感H5N1亚型HA基因序列,设计了一对特异性引物,提取禽流感H5N1亚型病毒RNA,并利用一步法RT-PCR方法扩增HA部分基因,与pMD18-T载体连接克隆扩增并鉴定后提取质粒与32a质粒同时分别双酶切并进行连接克隆扩增,提取重组质粒后转入E.coli Rosetta细胞中进行原核表达,通过检测证明得到了可溶性表达,大小约为35kD左右。从而为进一步试验和研究打下了坚实的基础。  相似文献   

传染性支气管炎N基因克隆及在大肠杆菌中的可溶性表达     

呼延蓉  郭伟伟  李明义  黄保续 《中国动物检疫》2010,27(4):35-38

核衣壳蛋白(N)是鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的重要结构蛋白。根据GenBank报道的IBV的M41株的N基因序列设计一对引物,从提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技术扩增获得了约1.23kb的片段,将该片段插入克隆载体pMD18-T,经测定核苷酸序列证实N基因扩增正确,表明已成功构建pMD18-T-N。再将pMD18-T-N用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌Rossetta中,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白,Western-blotting检测表明N蛋白可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应,表明N蛋白有一定的生物活性,可为用于生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础。  相似文献   

H5N1亚型禽流感病毒和新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞IFN-β基因的动态表达     

高艳  杨松沛  雷小文  岳华  李明义  汤承 《中国畜牧兽医》2010,37(3):78-83

根据鸡β-干扰素（ChIFN-β）基因保守序列设计引物建立了检测鸡IFN-β mRNA表达水平的荧光定量RT-PCR (RRT-PCR)方法,并对H5N1亚型禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒强毒株（vNDV）感染后3、6、12、24、30 h的鸡胚成纤维细胞（CEF）中IFN-β mRNA表达水平进行了检测。结果显示,建立的RRT-PCR特异性好,对鸡IFN-β mRNA的扩增效率为94.18%,线性范围为10^-8～10^-3,相关系数为0.992,最低能检出48拷贝/反应。AIV在感染CEF后6、12 h显著抑制IFN-β mRNA的表达,24 h开始诱导IFN-β mRNA表达,30 h时IFN-β mRNA水平显著升高;vNDV在感染CEF后的24 h内显著抑制IFN-β mRNA的表达,30 h时则显著诱导 IFN-β mRNA表达。本试验结果为进一步研究H5N1和NDV与机体的相互作用提供了有价值的信息。   相似文献   

禽流感免疫鸡不同途径攻毒后病毒分离试验报告     

刘志军  李明义  潘耀谦  宋灿军  万锐  郑彬 《黑龙江畜牧兽医》2006,(11):77-79

目前,对于禽流感防控,灭活疫苗最为安全有效,然而在对高致病性禽流感疫苗免疫效力的评价上,国内外均以控制临床症状为标准,在对抗感染方面报道较少。试验对不同抗体水平的鸡,采用不同途径攻毒进行病毒分离,研究免疫鸡抗体水平与抗感染的平行  相似文献   

TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒   总被引：1，自引：0，他引：1  

马莉  汤承  岳华  李明义  张彬  张兆敏 《黑龙江畜牧兽医》2009,(2)

根据GenBank中100个H5亚型禽流感病毒分离株的HA基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系和条件进行优化,并对该方法进行评价.结果表明:该方法对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其他家禽常见病原RNA无扩增;敏感度高,最低检测限为21个拷贝质粒DNA;可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2.01%和4.93%;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4 h.  相似文献   

多出水口立式泵的出水口性能参数的研究     

庞伟  李明义 《排灌机械》2000,18(3):1-3

消防水泵是高层建筑消除系统中的重要组成部分。该文在简要介绍了一种新型多出水口立式泵的特点后,着重讨论了该新型泵的两个出水口同时工作时各出水口性能参数的分配规律,并给出了合理选型时总流量的推荐值,具有一定的实用价值。  相似文献   

塞内卡病毒多克隆抗体的制备及其在免疫组织化学中的初步应用     

杨珍  江之瑶  夏玉洁  马凤龙  李心清  郭亚飞  杨洁  李明义 《中国兽医杂志》2023,(8):72-76

为了制备纯度高、特异性强的塞内卡病毒(SVA)多克隆抗体并研究其在免疫组织化学(IHC)中的应用，本试验用甲醛溶液灭活SVA,将其与矿物油佐剂充分混合乳化后，接种兔制备多克隆抗体并测定中和抗体效价，经Protein A亲和层析介质纯化，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定抗体纯度，用斑点杂交法(Dot blot)鉴定抗体特异性；以该抗体作为一抗，应用IHC技术检测SVA感染猪的蹄部组织切片中抗原的表达情况。结果显示，制备的SVA多克隆抗体中和抗体效价为1∶1 024,纯化后的抗体经SDS-PAGE鉴定仅有分子量约55 kDa和25 kDa两条目的蛋白条带；Dot blot结果显示，该抗体特异性强，最低检测浓度为0.15μg/mL;IHC结果显示，该抗体在1∶500稀释时能够检测到组织切片中抗原的表达。结果表明，本试验制备的SVA多克隆抗体符合IHC技术要求，可为下一步SVA致病机理研究提供重要的试验材料。  相似文献