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猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立 总被引：2，自引：3，他引：2
对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法。采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段。其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性。对107EID50/0.1mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102EID50的病毒量核酸。对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致。试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型。 相似文献
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利用RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Zhejiang/7/2004(H9N2)(SW/ZhJ7/04)HA基因,测序后将其克隆到真核表达载体pCAGGS上,经酶切分析、PCR鉴定和测序验证,得到重组表达质粒pCAGGS-HA,之后将其转染293T细胞,48h后收集转染细胞样品,进行SDS-PAGE分析,结果显示HA蛋白获得了表达。经Western blot检测,结果表明pCAGGS-HA能够在体外瞬时表达具有免疫学活性的HA蛋白,通过免疫小鼠,对其免疫效果进行了初步研究。 相似文献
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将重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP以不同免疫剂量接种BALB/c小鼠,通过检测小鼠免疫后的抗体以及抵抗H5N1亚型流感病毒攻击的保护对rAd-H5HA-EGFP的免疫保护性进行了评估。分别以108 TCID50、107 TCID50的rAd5-H5HA-EGFP免疫小鼠,初次免疫后3周进行加强,剂量为2×108 TCID50和2×107 TCID50,同时以接种rAd5-EGFP和PBS的小鼠作为对照。二免后3周,将各组试验小鼠随机分为2组,分别应用106 EID50的SW/FJ/1/01株和CK/HuN/77/05两株H5N1亚型流感病毒进行攻击。结果显示,重组病毒108 TCID50和107 TCID50的免疫剂量均能够诱导高水平的HI抗体生成,rAd-H5HA-EGFP免疫小鼠在受到病毒SW/FJ/1/01和CK/HuN/77/05攻击后,与接种腺病毒rAd-EGFP和PBS的对照组小鼠相比,没有出现明显的体质量减轻,攻毒后病毒在免疫小鼠体内的复制被完全或部分抑制,脏器内检测到的病毒含量明显低于对照组小鼠;免疫小鼠在受到CK/HuN/77/05毒株攻击时,没有出现死亡(0/5),而接种rAd-EGF... 相似文献
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一株H1N1猪流感病毒的进化分析与分子特征 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】了解猪流感病毒的分子流行病学,为动物流感的防控提供科学依据。【方法】将猪的鼻拭子接种鸡胚进行病毒分离,对血凝试验阳性的样品在SPF鸡胚上进一步纯化、增殖,采用RT-PCR对分离毒株的全基因组进行扩增,使用Applied Biosystems 3500xL Genetic Analyzer进行序列测定,利用DNASTAR软件对测序基因片段进行整个阅读框的核苷酸序列同源性比对分析,并用 MEGA 6.0绘制遗传进化树及分析氨基酸位点。【结果】分离毒株A/swine/Zhejiang/245/2013（SW/ZJ/245/13）为H1N1亚型病毒,核苷酸的分析结果发现该分离毒株的8个基因片段均与中国近期分离的H1N1亚型流感病毒高度同源,属于类禽型猪H1N1的进化分支,没有出现不同基因型流感病毒片段之间的重组。分离株HA蛋白的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病力流感病毒的分子特征;HA蛋白5个抗原位点区域与其同源性最高毒株完全一致,表明抗原性未发生改变;HA蛋白受体结合位点中190 D以及225 E,表明SW/ZJ/245/13与SA-α-2,6-Gal受体有较强的结合能力,而SA-α-2,6-Gal受体普遍存在于哺乳动物宿主（猪和人）上呼吸道中;HA共有6个潜在糖基化位点,其中4个（N27、N40、N212和N291）位于HAl区,2个（N498和N557）位于HA2区;NA有7个潜在糖基化位点,其中4个（N50、N58、N63和N68）在链接区,其他3个（N88、N146和N235）在结构域;PB2蛋白具有271T、627E和701N的氨基酸组合;M2蛋白发生抗药位点S31N的突变。【结论】 类禽型H1N1猪流感病毒的持续存在和不断变异,提示应加强猪流感的监测,为动物流感的防控提供重要的科学依据。 相似文献
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利用真核表达的猪流感病毒NP蛋白制备其特异性的单克隆抗体 总被引：1，自引：0，他引：1
为制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)单克隆抗体(MAb),本研究将重组质粒pMD-NP中含有的SIVNP基因亚克隆于pCAGGS真核表达质粒中,获得重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4周龄～5周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,利用杂交瘤细胞融合技术获得1株稳定分泌抗SIVNP的MAb杂交瘤细胞株(3D7);该MAb经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2亚型SIV发生特异性反应,具有良好的反应活性。该MAb的制备将为进一步建立猪流感的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。 相似文献
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RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5HA-EGFP.采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5HA-EGFP).经目的基因PCR检测及序列测定,结果表明:HA基因已经正确地插入到腺病毒的基因组中;通过RT-PCR检测与Western blot分析,结果表明:HA基因能够进行正确转录,并且所表达的蛋白具有相应的生物学活性.子代重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP经增殖、纯化后感染性滴度可达2.26×1010 TCID50 mL-1.rAd-H5HA-EGFP免疫BALB/c小鼠能够诱导特异性的HI抗体产生,有效阻止病毒在体内的复制. 相似文献
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兽医学是随着人类社会的发展以及人类在饲养畜禽并与疾病作斗争的长期过程中发展起来的 ,是研究动物生命活动规律、疾病诊断、治疗和预防的科学。随着现代科学技术的进步及各学科间的相互渗透 ,兽医学形成了包括基础兽医学、临床兽医学和预防兽医学三大专业诸多学科相互促进、相互渗透的完整的科学体系。预防兽医学是在实地调查应用和科学实验相结合的过程中发展并随着科学技术的不断发展而逐步充实完善的科学。其研究方向主要包括禽病学、兽医传染病学、兽医微生物学、兽医免疫学和兽医寄生虫学等学科及其相关的分支学科 ;并逐渐形成了兽医… 相似文献
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为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP.利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔEl,E3Cre共转染HEK293细胞.根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP.本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础. 相似文献
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为了解猪流感病毒(SIV)在我国的流行情况,本研究对2011年～2012年从不同省市重点地区屠宰场、规模化猪场和个体养殖户采集猪血清样品13044份,以经典H1N1 (CS)、类禽H1N1 (EA)、甲型H1N1(pdm/09)、H3N2、H5N1、H9N2亚型SIV抗原并采用血凝抑制(HI)方法检测.结果显示,2011年～2012年我国猪血清中类禽H1N1亚型SIV抗体平均阳性率比其他亚型高,分别为42.24％和45.89％,2011年甲型H1N1亚型SIV血清抗体平均滴度(GMT)比其他亚型高,GMT为53.32,2012年经典H1N1 GMT比其他亚型高,GMT为73.2.结果表明2011年～2012年我国猪群中H1N1亚型SIV感染较为普遍. 相似文献
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表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒对小鼠免疫原性的研究 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】构建一株表达H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因的复制缺陷型重组腺病毒,并测定其对小鼠的免疫效力。【方法】以含有SIV A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)HA基因的重组质粒pMD18-H3HA为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因,将其亚克隆入质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有H3HA及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP。利用脂质体转染方法将穿梭质粒pDC315-H3HA-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP。将重组病毒rAd-H3HA-EGFP以108TCID50两次接种6周龄的Balb/c小鼠,时间间隔为3周,通过检测免疫小鼠的抗体水平及对病毒攻击的保护情况评价该重组病毒的免疫原性。【结果】HA基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物性活性。重组腺病毒rAd-H3HA-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.58×1010.mL-1,以108TCID50的剂量免疫小鼠后,能够诱导产生高水平的特异性抗体,并对H3亚型SIV的攻击提供有效保护。【结论】构建了一株具有良好免疫原性的复制缺陷型重组腺病毒,为H3亚型SI活载体疫苗的研制奠定了基础。 相似文献