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马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建 总被引：8，自引：1，他引：7
采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 ,为进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础 相似文献
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O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立 总被引：4，自引：2，他引：2
本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-OY/S/CHA/05.将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养可见典型的细胞病变(CPE).同时,将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,同样也观察到典型的CPE.对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记,即在病毒核酸的3 510位人工消除了Xba Ⅰ酶切位点.免疫电镜观察和间接免疫荧光试验进一步表明,拯救出了FMDV.病毒生长比较试验表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的增殖特性.本研究构建了O型口蹄疫病毒的感染性克隆并获得了拯救病毒,为深入研究FMDV的致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台. 相似文献
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马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题.本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266-HIS.将pOK8266-HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子.提取pOK8266-HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础.本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制. 相似文献
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为建立猪相关细胞因子的检测方法,本研究针对GenBank中猪IFN-γ、IL-2、TNF-α的基因设计特异性引物和荧光探针,建立了这3种细胞因子TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,建立的检测方法在101～109拷贝/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数R2均高达0.999。利用该方法对猪瘟(CSF)活疫苗进行细胞免疫评价,结果显示,CSF疫苗免疫组猪瘟病毒(CSFV)刺激细胞相对于空白对照细胞,IFN-γ、IL-2、TNF-αmRNA表达量在免疫后3 d～10 d之间均显著升高(p<0.05),而IFN-γ在14 d仍保持高水平表达;对照组CSFV刺激细胞和空白对照细胞的3种细胞因子表达量均无明显差异(p>0.05)。以上结果表明,该方法具有高度的特异性、敏感性和重复性,对不同疫苗的细胞免疫反应评价是可靠的。 相似文献
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利用Real-time PCR和Real-time RT-PCR方法对马传染性贫血病(EIA)驴白细胞弱毒疫苗(DLA-EIAV)、DLA-EIAV感染性分子克隆衍生毒(vOK8226)、强弱毒嵌合病毒(vOKVltr)以及EIA强毒接种马后不同时期外周血白细胞中前病毒含量及血浆中病毒含量进行了监测,结果发现直接攻击强毒的2匹马及1匹接种vOK8226后再用强毒攻击的马血浆中病毒含量快速升高,伴随着明显的临床反应,最后均以死亡结束.其它免疫接种马在攻击强毒后均获得保护,没有发病,马血浆中有低水平病毒存在,攻毒后3个月血浆中检测不到病毒,说明感染马体内病毒的大量增殖与疾病的进程有着直接的关系.而外周血白细胞中前病毒的含量在各试验马各时期均能检测到,说明EIAV以前病毒的形式潜伏在感染马体内,疫苗的免疫只能控制发病,而不能清除感染的病毒. 相似文献
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为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)不同致弱代次病毒对断奶仔猪胸腺的损伤,本研究选用HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞中传代致弱的F5、F15、F23、F30代及弱毒疫苗HuN4 F112代分别接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性健康断奶仔猪。实验结果显示:HuN4 F30感染组胸腺的眼观病变、胸腺重量、病理组织学变化、病毒载量及胸腺细胞凋亡比例均与F23感染组有显著差别(p<0.05)。本实验结果表明,HuN4 F23代仍然能够引起仔猪胸腺萎缩并导致机体免疫抑制,而F30代已不能引起断奶仔猪胸腺萎缩现象。因此,HP-PRRSV HuN4 F23、F30代可以作为研究HP-PRRSV HuN4致胸腺萎缩的分子机制的关键代次。本研究为进一步研究HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺萎缩和胸腺细胞凋亡的分子机制奠定了基础。 相似文献