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PCR扩增山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55的TK（Thymidine kinase）基因作为侧翼序列;用XhoⅠ/NotⅠ消化含有报告基因的质粒pLSEG得到痘苗病毒（Vaccinia virus,VV）p7.5启动子调控大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（E.coli.gpt）作为报告基因;人工合成VV I1L启动子用于调控表达外源基因,用Overlap PCR的方法将VV I1L启动子和VV p7.5启动子调控的gpt连接但使两启动子转录方向相背,并在VV I1L启动子下游引入XhoⅠ位点作为外源基因的插入位点,构建成表达载体元件I1L-P7.5-GPT。将I1L-P7.5-GPT插入TK基因的Acc65Ⅰ位点,构建成表达载体。将构建的载体转染山羊痘病毒G14-STV44-55株感染的羔羊睾丸细胞,用含有霉酚酸（Mycophenolic acid,MPA）等筛选试剂的培养基筛选重组山羊痘病毒（rGTPV）。结果显示,构建成以TK基因为侧翼、以VV I1L启动子调控目的基因,以gpt为报告基因的表达载体pGEM-TK-I1L-GPT,成功筛选到表达gpt的rGTPV,rGTPV至少可稳定传代15代。结果表明,构建了我国山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株的表达载体;TK基因是GTPV G14-STV44-55疫苗株的复制非必需区,以TK基因为插入位点获得的重组病毒可稳定传代15代以上。 相似文献
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为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。 相似文献
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以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的保守基因5'-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%(18/25),与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。 相似文献
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绵羊嗜皮菌病PCR诊断方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立动物嗜皮菌病的PCR检测方法,根据GenBank发表的刚果嗜皮菌属的部分16s-rRNA基因序列,设计了1对特异性引物.经PCR扩增,从发病绵羊皮肤病料提取的基因组DNA得到了大小约500 bp的DNA片段.将PCR产物克隆并测序表明,与GenBank发表的刚果嗜皮菌基因序列的同源性为90.632%.而猪胸膜肺麦放线杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、肠球菌扩增结果为阴性;PCR的敏感性试验显示,这时引物能够检测到1 ng的DNA.表明此PCR方法特异性好,敏感性高,可用于嗜皮菌病的快速诊断. 相似文献
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根据已报道的绵羊种布鲁氏茵外膜蛋白基因omp2b的核酸序列设计引物，从新疆绵羊种布鲁氏菌基因组中扩增到了omp2b基因。将该片段克隆到PBS—T载体上，并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定，证明所得到的片段为阳性重组子。与报道的绵羊种布鲁氏菌omp2b序列有89．72％的同源性，并在N端存在高度保守区。至此得到omp2b基因的全长克隆，通过对所克隆的基因和其他布鲁氏菌外膜蛋白omp2b的进化树分析，发现其和牛种布鲁氏茵的亲缘关系最近，同源性较高。 相似文献
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戊型肝炎病毒(HEV)是一种RNA病毒,引起一种急性传染性肝炎—戊型肝炎(HE),戊型肝炎主要经粪—口途径传播,通常是由于饮用被HEV污染的水而引起。其中,在亚洲、非洲和美洲等发展中国家人群中发生比较普遍,在一些地区可占到急性病毒性肝炎的50%,是导致发病和病死的重要因素。中国是戊肝高流行区,发病数、发病率均呈现连续快速增长的态势。人类对HEV普遍易感,在孕妇中可导致流产或死亡,病死率高达到20%￣30%,易感人群以大龄儿童和青壮年为主,幼儿少见。HEV不仅可以侵犯人类,而且可以在动物中广泛分布和传播,戊型肝炎是一种人畜共患性传染病。在此,从病原学、流行病学、检测方法及其疫苗的研制几个方面对其进行了综述。 相似文献
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采用PCR技术,以绵羊外周血白细胞基因组为模板,扩增绵羊慢病毒gag基因全长,将该基因克隆到pBS-T载体上,将重组子转入感受态细胞DH5α,用IPTG/X-gel筛选阳性菌落,通过菌落PCR,酶切初步鉴定后测序,所测序列与Genbank中的基因序列进行比对,所克隆序列与慢病毒gag基因序列一致。实验表明:在绵羊的白细胞慢病毒的cDNAgag基因的PCR检测是可行的。 相似文献
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盐胁迫对阳桃光合特性的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
以二年生阳桃幼苗为试验材料,研究在不同NaCl浓度胁迫条件下叶片光合作用的变化。结果表明:低盐胁迫(0～60 mmol/LNaCl)下Chl a、Chl b、Chl a+Chl b和Chl a/Chl b含量缓慢下降;高盐胁迫(100～300mmol/LNaCl)显著降低叶绿素含量、水分利用效率、叶片光合能力。阳桃在低于60 mmol/LNaCl的盐土里能维持正常生长。 相似文献
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为研究miRNA-125b在致细胞病变牛病毒性腹泻病毒(cpBVDV)感染牛肾细胞(MDBK细胞)过程中诱导细胞凋亡的机制,本研究将cpBVDV感染MDBK细胞,并将构建的pcDNA-miR-125b转染MDBK细胞作为阳性对照.采用荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)检测细胞中miRNA-125b和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2) mRNA转录水平,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率.检测结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞12 h和24 h,细胞中miRNA-125b的转录水平分别为正常细胞对照组的2.01倍和3.85倍,Bcl-2 mRNA的转录水平分别为对照组的0.71倍和0.31倍;pcDNA-miR-125b转染MDBK细胞48 h后,Bcl-2 mRNA的转录水平为正常细胞对照组的0.42倍.细胞凋亡检测结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞12 h和24 h,细胞的凋亡率分别为15.06％和36.43％;pcDNA3.1-miR-125b转染48 h,细胞的凋亡率为25.56％.结果表明miRNA-125b在cpBVDV感染MDBK细胞过程中能够通过抑制抗凋亡基因Bcl-2 mRNA转录水平从而诱导细胞产生凋亡. 相似文献