禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析     

罗维玉  胡永浩  张杰  王金光  朱鹏阳  梁立滨  周圆  李呈军  姜丽 《农业生物技术学报》2016,(10):1482-1490

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70％;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一.本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) (A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01 (H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析.首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得cDNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切将其定向插入pGEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达.该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出.为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析.结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90％以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S 1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好.研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料.  相似文献   

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究   总被引：3，自引：3，他引：0  

倪春霞  蒲万霞  胡永浩  邓海平 《中国农业科学》2011,44(2):417-422

 【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。  相似文献   

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段原核表达条件的优化     

郝宝成  梁剑平  兰喜  刑小勇  项海涛  温峰琴  胡永浩  柳纪省 《湖北农业科学》2011,50(15):3116-3119

为了提高猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段在大肠杆菌中的表达量,研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对衣壳蛋白基因CP239片段融合蛋白表达量的影响。结果表明,用LB培养基于37℃培养3.5 h后,采用终浓度为0.3 mmol/L的IPTG在37℃、200r/min诱导培养4 h,pET32a-CP239融合蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测结果表明pET32a-CP239融合蛋白的分子质量与预期大小一致,约为45.3 ku;Western blotting结果表明,pET32a-CP239融合蛋白可以与抗-HEV阳性血清发生特异性反应,并具有良好的反应原性,说明衣壳蛋白基因CP239片段蛋白得到正确表达。  相似文献   

产苦马豆素疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis的诱变筛选     

郝宝成  宋向东  高艳  王学红  刘宇  李元曦  梁妍  陈柯源  胡毓瑶  邢小勇  胡永浩  梁剑平 《中国农业科学》2019,52(15):2716-2728

【背景】疯草是黄芪属和棘豆属有毒植物的统称,疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis是从疯草中分离获得的一种具有产生苦马豆素（swainsonine,SW）能力的真菌。因其产物SW一方面体现出良好的抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移作用及潜在的抗艾滋病病毒等多种药用活性,另一方面牛羊因大量误食疯草能导致中毒,对草原畜牧业健康发展造成了严重的危害,受到研究人员的广泛关注。但由于疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制尚不清楚,严重制约了后续通过生物发酵大量获得SW用以抗肿瘤机制研究与临床应用,以及通过基因工程手段对疯草进行脱毒育种,使疯草成为牛羊可食用、无毒的天然牧草。【目的】利用有效的研究手段,阐明Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制。【方法】以Alternaria Section Undifilum oxytropis为出发菌株,分别采用紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变的3种诱变方式,在不同诱变时间、诱变剂量等条件下对其进行了诱变筛选研究。通过测定不同诱变方式和作用条件下对菌株的致死率,经发酵培养、连续5代传代培养、并采用α-甘露糖苷酶活性分析法检测诱变菌株产苦马豆素含量变化,优化确定了不同诱变方式下最佳诱变条件,并将优势突变菌株接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar,PDA）和改良察式液体培养基,连续培养32 d,测定并绘制了突变菌株D4和UD1的生长周期曲线。【结果】经上述3种诱变方式处理后,分别获得1株产苦马豆素含量变化较大、能稳定连续传代培养的突变菌株U4、D4、UD1。其优化的诱变条件,紫外辐照为辐照处理160 s,亚硝基胍化学诱变为亚硝基胍诱变剂量6 μL、诱变处理时间5 min,紫外辐照与亚硝基胍复合诱变为紫外辐照20 s,亚硝基胍诱变剂量2 μL,诱变处理时间5 min。突变菌株U4、D4、UD1较原始菌株,菌落形态偏小、中间凸起,菌落颜色呈微粉色或白色,且其产苦马豆素含量均有显著变化,其中U4突变菌株产苦马豆素量平均增加16.02%（P<0.01）、D4 突变菌株产苦马豆素量平均降低23.58% （P<0.01）,UD1 突变菌株SW产量平均增加21.87%（P<0.01）,但D4、UD1突变菌株生长周期与出发菌株一致,均为24 d。【结论】通过紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变方法,成功筛选出产苦马豆素含量变化较原始菌株差异较大的3株突变菌株U4、D4、UD1,这为后续利用高通量测序等分子生物学手段,在分子水平上阐释疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis关键基因、关键酶在其生物合成苦马豆素机制关系方面奠定研究基础。  相似文献   

3例奶公犊眼部疾病治疗     

邵倩  白涛涛  胡永浩 《甘肃畜牧兽医》2016,(15):65-66

2016年5月宁夏银川某肉牛养殖场购入的两月龄断奶公犊陆续出现眼部疾病。除一起外伤引起的眼球脱出外,其余病程均为流泪、羞明、角膜炎、晶状体脱落等。本文对其诊疗过程进行介绍,以供参考。  相似文献   

H9N2亚型禽流感病毒PA基因的克隆与序列分析     

易华山  侯顺利  胡永浩  独军  刘萍  王光华  高闪电  常惠芸 《甘肃农业大学学报》2007,42(3):12-16

对甘肃H9N2亚型的A/Chicken/GanSu/2/99(A/CK/GS/2/99)株PA基因进行了克隆、测序及分子进化分析.结果表明:该病毒PA基因开放阅读框由2 151个碱基组成,编码716个氨基酸;其与A/Quail/HongKong/NT28/99(H9N2)株和A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)株的核苷酸同源性分别为98.4%和98.5%,氨基酸同源性分别为98.7%和98.7%;与A/HongKong/156/97(H5N1)和A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)的核苷酸同源性分别为89.0%和87.8%,氨基酸同源性分别为为93.9%和94.3%.  相似文献   

A型口蹄疫病毒抗原表位与牛IgG重链恒定区的融合表达及活性鉴定     

陈建文  王兴叶  邵军军  郝春霞  常惠芸  胡永浩 《动物医学进展》2013,34(7)

为了研制广谱高效的A型口蹄疫新型多表位疫苗,根据GenBank数据库的A型代表毒株VP1序列设计并合成了VP1结构蛋白上的主要抗原表位DNA段,即135 aa～160 aa和200 aa～213 aa,与牛IgG重链恒定区编码基因连接,将合成的2个表位基因经Xho工、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后依次克隆到pET-30a(+)载体上,构建重组质粒pRE2IgG,将其转化到大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,以IPTG诱导表达融合蛋白pRE2IgG,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,Western blot检测.结果显示,重组蛋白获得高效表达,并以包涵体形式存在,其分子质量约为60 ku,且能与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.  相似文献   

反向疫苗学:后基因组时代疫苗研究新途径   总被引：4，自引：0，他引：4  

胡永浩  沈正达 《中国兽医学报》2004,24(4):414-416

传统疫苗(活苗、死苗、亚单位苗)在人畜疫病的防制上发挥着重大作用,对世界范围内唯一被消灭的天花,痘苗的发展及应用功不可没。但由于传统制苗方法受若干因素的限制,如有些病原微生物难于在体外培养,或易于发生变异,或免疫原性微弱甚至缺如,以致目前仍有不少危害严重的疫病,尚  相似文献   

西北地区鸡新城疫流行病学调查情况分析   总被引：4，自引：0，他引：4  

伏小平  张银田  胡永浩  余四九 《中国兽医杂志》2004,40(1):29-31

目前，鸡新城疫主要靠疫苗接种来控制和预防其流行，并取得了一定的成效，但是，由于新城疫的严重程度受病毒毒株的致病型、宿主种类、年龄、免疫状况、感染途径、病毒剂量、其他病原的共同感染以及应激因素的影响，加之低毒力毒株在野生飞禽中的流行以及弱毒疫苗的普遍使用，为本病的流行  相似文献   

狂犬病的分子生物学诊断   总被引：3，自引：0，他引：3  

殷相平柳纪省  胡永浩张兴旺  李志勇王辉  李宝玉兰喜 《中国兽医科技》2004,34(5):47-50

从攻击咬伤人并致其死亡的犬脑组织中提取总RNA，用特异性引物通过反转录聚合酶链反应(RT—PCR)获得了长度约为1423bp的核酸片段，与预期的片段大小相符；将扩增产物连接到pMD18-T载体中，转化大肠埃希氏菌JM109，筛选氨苄青霉素抗性菌落，提取质粒，经酶切鉴定、PCR分析及测序，证明所克隆的1423bp片段含有完整的狂犬病病毒N基因，与国外参考毒株的序列相比同源性较高，从而做出正确的诊断。试验表明，用RT—PCR技术检测狂犬病病毒灵敏度高、特异性强，适合于实验室应用。  相似文献