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【目的】查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮生物合成的第一个关键酶,从藤茶中克隆AgCHS1,分析其序列特征及其在藤茶中的组织表达特异性,通过体外酶活性检测和烟草遗传转化对其功能进行鉴定,为进一步研究藤茶类黄酮累积的调控机理提供理论基础。【方法】根据藤茶转录组测序结果设计引物,以藤茶叶片cDNA和基因组DNA为模板,PCR扩增得到AgCHS1。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA6和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建系统进化树。通过原核表达系统获得AgCHS1的重组蛋白,分析该重组蛋白对底物的催化活性,并通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)对酶促反应产物进行鉴定。利用qRT-PCR技术对AgCHS1在藤茶不同器官的表达水平进行分析,并采用硝酸铝比色法测定相应的总黄酮含量变化。构建植物过量表达载体,通过叶盘法转化烟草,筛选阳性转基因后代,对T2代株系花瓣中的花青素和黄酮醇含量进行检测。【结果】AgCHS1的ORF长1 182 bp,编码393个氨基酸,基因组序列长1 315 bp,含2个外显子和1个内含子。生物信息学分析表明,AgCHS1为稳定的亲水蛋白。通过与其他物种的CHS蛋白多序列比对发现,AgCHS1含有查尔酮合成酶家族的特征序列和活性位点残基,包括丙二酰CoA结合位点和三联活性中心位点,与其他物种的CHS序列一致性较高。系统进化分析显示,AgCHS1与葡萄、山葡萄的CHS处于同一进化分支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,AgCHS1在成熟叶和花中的表达量最高,在老叶中的表达量最低。藤茶不同器官的总黄酮含量与AgCHS1表达水平呈显著正相关。体外酶活性分析显示,重组的AgCHS1蛋白可以催化底物对-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素,说明该蛋白具有查尔酮合成酶活性。获得5株烟草转基因阳性株系,其中2株的花瓣颜色明显加深;与对照相比,转基因株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分别提高56.6%和25.3%,OE3的黄酮醇含量没有显著差异,OE4的黄酮醇含量提高39.1%。【结论】AgCHS1是藤茶中催化合成查尔酮的关键酶,过量表达AgCHS1可以提高转基因植物中花青素和黄酮醇的含量。 相似文献
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通过对安徽省农村体育发展的动力机制诸多问题进行探讨,综合分析了安徽省农村体育发展状况,提出了提高农民参与体育锻炼的意识、健全组织机构、加强农村体育文化建设等农村体育发展动力机制的对策,为全省发展农村体育运动提供一些有益的参考意见,以促进安徽省体育事业的发展。 相似文献
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对加工中心使用中相关人员的配备、人员技术要求、设备维修及保养等问题进行了探讨,并给出了处理这些问题的原则、方法及建议. 相似文献
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以公共经济学、全民健身等相关理论为基础,采用了问卷调查、专家访谈、理论分析等研究方法对安徽省城乡体育场地的状况进行深入研究探讨,指出其存在的问题,找出安徽省城乡体育场地建设中的制约因素,对安徽省城乡的体育场地建设提出发展战略,制定发展目标,进行合理的规划,提出了参考意见。 相似文献
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通过向家坝一期围堰基础防渗子堰体的施工,详细介绍了全液压钻机潜孔锤跟管一次成孔、并回填护壁材料的成孔技术,以及振孔高喷机实施高压旋喷灌浆的施工方法,施工中可能遇到的一些困难及其解决办法等。同时介绍了防渗幕体与剌墙的连接,一期围堰基础高喷防渗幕墙与子堰体高喷防渗幕体的连接等,可供同类大型水利水电基础工程施工参考。 相似文献
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