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本研究旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊BMP6基因表达载体及转染成纤维细胞后基因的表达量变化。实验以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,提取RNA并反转录成c DNA,参照Gen Bank中BMP6基因序列信息及pc DNA3.1载体序列设计1对含有同源臂的引物,通过PCR扩增获得BMP6基因片段、利用So So试剂盒将目的片段连接到pc DNA3.1真核表达载体上。鉴定pc DNA3.1-BMP6表达载体构建成功后,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pc DNA3.1-BMP6表达载体转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测BMP6基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:经酶切、测序鉴定pc DNA3.1-BMP6表达载体构建成功,并且转染成纤维细胞后BMP6基因的m RNA、蛋白表达量均明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P0.01)。在本实验条件下,利用同源重组技术成功构建了敖汉细毛羊BMP6基因表达载体,并且成功转染成纤维细胞,基因在细胞中过表达,为进一步研究其功能奠定基础。 相似文献
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本实验旨在利用同源重组技术构建敖汉细毛羊Chordin基因表达载体,将其转染至成纤维细胞中,分析Chordin基因mRNA及蛋白表达量的变化。以40日龄的胎羊为研究对象,采集组织样品,参照Genbank中Chordin基因序列设计一对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增目的基因片段,利用SoSo试剂盒将目的片段连接至表达载体pcDNA3.1上。鉴定后符合标准即可将pcDNA3.1-Chordin重组表达载体转至大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞振荡培养。经质粒提取后将重组质粒pcDNA3.1-Chordin转染至成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测Chordin基因在成纤维细胞中表达量的变化。结果表明:普通PCR反应产物经电泳检测后与目的基因大小一致,位于2874处,且条带单一无杂带;表达载体pcDNA3.1酶切效果良好,经电泳检测其大小位于5428 bp处,且条带单一无杂带;连接后经测序鉴定pcDNA3.1-Chordin表达载体无碱基突变,pcDNA3.1-Chordin表达载体构建成功;转染成纤维细胞后,经检测,转染组的mRNA以及蛋白表达量均极显著高于对照组。本实验成功构建了敖汉细毛羊Chordin基因的表达载体,并成功转染成纤维细胞且表达,为进一步对Chordin基因的功能研究奠定了基础。 相似文献
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敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒的构建及其在成纤维细胞中表达量的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究旨在构建敖汉细毛羊DKK1基因的重组质粒,并对其转染成纤维细胞后基因的表达量变化进行研究。试验采集敖汉细毛羊肱二头肌提取基因组DNA,参照GenBank中DKK1基因序列设计1对引物,PCR扩增获得DKK1基因片段,连接到pEASYTM-T1载体,构建pEASYTM-T1-DKK1重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定,鉴定正确后构建PmaxGFP-DKK1重组质粒,转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞;对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的重组质粒PmaxGFP-DKK1转染成纤维细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测DKK1基因在成纤维细胞中的表达量变化。结果显示,经酶切、测序鉴定发现,重组质粒PmaxGFP-DKK1构建成功,大小为3 956 bp,并成功瞬时转染成纤维细胞,转染细胞后DKK1基因的表达量明显升高,且转染组的表达量极显著高于对照组(P<0.01)。试验成功构建了敖汉细毛羊DKK1基因重组质粒,并成功转染成纤维细胞,为进一步研究DKK1基因的功能奠定基础。 相似文献
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为了构建敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因真核表达载体及单、共转染成纤维细胞后研究两基因表达量之间的变化,以敖汉细毛羊为研究对象,采集40日龄的胎羊。首先,通过RNA的提取反转录成c DNA参照Gen Bank中DKK1、BMP4基因序列信息分别设计1对含有同源臂的引物,通过PCR反应扩增获得DKK1、BMP4基因片段、利用So So试剂盒将目的片段连接到pcDNA3. 1真核表达载体上。鉴定正确后的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4重组质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;其次对敖汉细毛羊的成纤维细胞进行分离培养,并将构建的pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4单、共转染成纤维细胞,利用荧光定量PCR技术和Western Blot技术检测DKK1、BMP4基因单转染和共转染在成纤维细胞中表达量的变化。结果显示,经酶切、测序鉴定pcDNA3. 1-DKK1、pcDNA3. 1-BMP4构建成功,成纤维细胞原代、传代培养良好,转染后细胞生长良好,经实时荧光定量PCR技术和Western Blot检测DKK1基因共转染成纤维细胞较单转染的表达量极显著下降(P 0. 01),BMP4基因的共转染较单转染表达量没有发生明显变化。成功构建了敖汉细毛羊DKK1、BMP4基因的真核表达载体,并且成功共转染成纤维细胞,DKK1基因的表达量明显下降,BMP4基因的表达量没发生明显变化,因而,推断BMP4基因抑制了DKK1基因的表达,DKK1基因对BMP4基因作用不明显,结果可为进一步研究其功能奠定基础。 相似文献