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设计4对引物,利用RT—PCR技术分别扩增出新城疫病毒(NDV)V4株长约4.2、4.1、4.1、3.5kb的4个互相重叠的核苷酸片段,并分别进行了克隆和序列测定。将这4个片段的核苷酸序列拼接后,得到长为15 061 bp的核苷酸序列。该序列包含有NDVv4株结构基因NP的全部编码区和5’端非编码序列,结构基因P、M、F、HN及L基因的全部编码区和非编码区序列,各结构基因之间的间隔序列以及基因组5’端部分尾巴序列(108bp)。序列比较分析表明,NDVv4株F蛋白裂解位点序列为^112GKQGRL^117,HN基因编码616个氨基酸,符合无毒株的特征;NDVv4株同基因组长度为15 192 bp的毒株一样,在基因组的1647~1648bp间比基因组长为15192bp的毒株少了6个碱基。 相似文献
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新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析 总被引:3,自引:0,他引:3
设计了2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4,用RT-PCR法对新城疫病毒(NDV)V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约4.1kb的V4LA片段,用V4L3、V4L4扩增出约3.5kb的V4LB片段,分别对克隆出的2个片段进行序列测定,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接,得到长约7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为6704bp,拥有1个6615bp的开放阅读框,推测其编码的氨基酸数为2204个。氨基酸同源性分析表明:V4克隆株与HB92 V4株L基因的同源性为99.0%,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株)、Beaudette C、Clone30、F48E9、SF02和ZJ1株的同源性为94.1%~96.5%。 相似文献
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根据NDVP蛋白已知基因序列设计全盛了一对引物PU/PL,利用RT-PCR扩增出了F48E9株P基因在272bp的片段磁针 该片段克隆到pMD18-TVector上,并对所得到的重组质粒进行酶切分析,PCR鉴定,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子,为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性,采用Sanger's双脱氧末端终止法对阳性重组子从5’端进行核苷酸序列测定,获得了F48E9株P基因片段5’端的基因序列,利用DNASIS分析软件,将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较,其核苷酸序列同源性为83.7%,至此,我们获得了F48E9株P基因的全长克隆。 相似文献
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采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1mmol/LIPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDVV重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28ku,与理论值大小相符。将包涵体用8mol/L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300μg/只),成功制备了抗鸡NDVV蛋白的抗血清。 相似文献
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将新城疫病毒(NDV)F48E9株的F和HN基因克隆到真核细胞表达载体pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,筛选出含有F和HN基因的重组质粒,命名为pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化的质粒转染Vero细胞后,经间接免疫荧光试验检测到蛋白的表达。pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒共转染Vero细胞后,观察到明显的细胞融合现象。结果表明NDV F48E9株的F和HN蛋白在真核细胞内得到了真实的表达,并且表达产物具有天然蛋白活性。 相似文献
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通过对NDV不同基因型毒株HN基因的氨基酸序列进行比较,发现基因Ⅶ型的毒株在第65~75位的氨基酸序列较为保守,而其他各基因型在该区域则呈现出多态性。因此克隆了新城疫基因Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ型的代表性毒株LaSota、GX-2、F48E9的含该区域的序列,分别将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上,通过特异性抗血清对表达肽段进行抗原性测定。结果表明3个毒株在免疫活性上存在差异,分析其原因可能是由于氨基酸的极性不同所致。 相似文献