一株表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒的构建及其复制稳定性分析          下载免费PDF全文

杨明珠  陈晓春  张媛  王秀丽  李俊平 《中国兽药杂志》2022,56(5):1-9

为探寻伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）基因缺失株rPRV-bc-8基因组UL4-UL3基因间区域是否可作为外源基因的插入位点，在实验室已构建的含有增强型绿色荧光蛋白（Enhance Green fluorescent protein，EGFP）基因的转移质粒pMD-US6+7-EGFP-US2的基础上，通过DNA体外分子克隆技术将UL4序列替换左同源臂US6+7序列，UL3序列替换右同源臂US2序列，并将PolyA引入转移质粒，得到转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3。利用脂质体转染法将转移质粒pMD-UL4-EGFP-UL3与亲本毒rPRV-bc-8共转染PK-15细胞，经蚀斑纯化成功得到一株能够稳定表达EGFP基因的重组伪狂犬病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3。通过倒置荧光显微镜观察以及PCR鉴定确定EGFP基因已成功插入到伪狂犬基因组的UL4-UL3之间，并通过细胞传代试验分析得到重组毒的遗传稳定性良好。通过体外增殖试验分析得到重组病毒rPRV-UL4-EGFP-UL3在细胞内的增殖速度较快，接种后12 h内滴度始终高于亲本毒rPRV-bc-8，接种后40 h达到最高滴度10^8.3 TCID₅₀/mL，与亲本毒的最高滴度接近，但是最高滴度的出现时间晚于亲本毒，并且在达到平台期后病毒滴度下降的比亲本毒快。通过对病毒培养液中荧光蛋白浓度进行测定，结果显示在接种后56 h时荧光蛋白浓度达到最高值4793.9 ng/mL，之后进入平台期。综上结果表明构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力，并且外源基因EGFP在此位点具有良好的表达效果，为进一步相关重组病毒的构建奠定了基础。  相似文献   

重组动物疱疹病毒活载体疫苗的构建与应用研究进展     

杨明珠  陈晓春  宋佳诚  侯亚欣  李俊平 《中国畜牧兽医》2022,49(1):338-351

重组病毒活载体疫苗是通过基因工程方法构建的活载体疫苗，规避了传统疫苗的一些缺点，具有极大的优势和应用前景。目前被广泛用作重组病毒载体的动物疱疹病毒有火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）、伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、鸭瘟病毒（Duck enteritis virus，DEV）、鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）等。对疱疹病毒基因组序列进行分析显示，其基因组大，复制非必需区域多，容纳外源基因的能力强。同时疱疹病毒具有宿主范围广泛、免疫持续期长、安全性较好及相关基因操作技术成熟等优点。笔者总结了当前构建重组动物疱疹病毒的主要方法，包括传统同源重组技术、细菌人工染色体（BAC）技术、Fosmid文库及CRISPR/Cas9基因编辑技术，简述了各个方法的基本原理及技术特点，比较了各个方法的优缺点，并分析了各个方法的最适运用条件，从而更准确地为研究工作提供理论及技术参考；对外源基因的表达方式进行分析，论证了不同启动子对外源基因表达的调控作用不同，同时对不同疱疹病毒的常用插入位点进行了研究成果的列举总结，并对当前重组病毒HVT、PRV、DEV及ILTV活载体疫苗的研究进展进行总结，对相关生物制品的注册应用信息进行了归纳，介绍了高选择率外源基因及高成功率插入位点，从而为相关生物制品的研制提供理论参考。  相似文献   

副流感病毒5型SH蛋白单克隆抗体的制备          下载免费PDF全文

吴华伟  刘丹  陈晓春  高金源  邓永  秦义娴  苏佳  黄小洁  薛青红  陈延飞 《中国兽药杂志》2021,55(11):1-7

为获得副流感病毒5型SH蛋白的单克隆抗体，将构建的重组表达质粒pET43a-SH转化BL21(DE3)plys，经IPTG诱导表达、过镍柱纯化后将重组蛋白作为免疫原，免疫8周龄Balb/c雌性小鼠，并按常规方法制备杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光方法进行筛选，获得3株杂交瘤细胞株，命名为5B9、3G8、4E11，并进行了培养特性、分泌抗体活性、分泌抗体亚类的鉴定。结果显示：3株细胞株连续传代10代均稳定分泌单克隆抗体，细胞上清液IFA效价稳定，分泌单克隆抗体亚型均为IgG2a。制备并纯化了1株(5B9)单克隆抗体，浓度为4.26 mg/mL，纯度不低于90%，IFA效价不低于1∶2000，与猪牛等常见病毒均无交叉反应。  相似文献   

基于层次分析法的国防生淘汰因素分析     

李顺宏  陈晓春  李辉亿  朱丹 《湖南农业大学学报(自然科学版)》2009,(3)

利用若干所高校被淘汰的国防生的数据,通过德尔菲打分法,计算出了权重矩阵.根据若干所高校国防生的实际数据,运用不同的标度,得出了两个国防生培养的风险函数.通过对风险函数的进一步分析,得到应加强计算机专业和中西部地区贫困家庭国防生的培育管理,应注重培养国防生的综合素质等结论.  相似文献   

“科学发展观与农业可持续发展”研讨会综述          下载免费PDF全文

陆彦  徐春迎  陈晓春  阮文彪 《安徽农业大学学报》2005,(4):40-44

在安徽农业大学召开的‘科学发展观与农业可持续发展”学术研讨会上，来自全国科研院所、高等学校的40多位专家学者围绕‘科学发展观与农业可持续发展”这一会议主题，就科学发展观的理论内涵和观念培育，建国以来我国农业发展过程中的认识误区与经验教训，在当前和今后我国农业和农村工作中贯彻落实科学发展观的难点和重点，农业和农民教育、乡村文化建设与农业可持续发展，城乡统筹、区域协调发展问题与政策等一系列重大理论和实际问题展开了热烈讨论和坦诚交流，提出了很多颇有见地和具有参考价值的观点及政策建议。  相似文献