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通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ（si-HSD17B4）基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA （siRNA）和1条对照si-HSD17B4-nc （si-nc）,并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织（P<0.05）。3条HSD17B4 siRNA片段均能有效地抑制HSD17B4基因的表达,其中si-HSD17B4-1干扰效果最佳,HSD17B4 mRNA表达量极显著低于对照组（P<0.01）;最佳干扰时间为24 h。酪蛋白检测结果显示,干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成无影响。甘油三酯测定结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中甘油三酯含量上升,差异显著（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中的脂滴明显增多。实时荧光定量PCR检测结果显示,干扰HSD17B4基因会使FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2、PLIN2、BTN1A1基因表达量上调,分别上调9.28（P<0.01）、1.36（P<0.05）、1.17（P<0.05）、1.83（P<0.01）、1.60（P<0.01）和2.17（P<0.01）倍;同时使PPARA、SREBP1C、SCD、ACSS2、ACACA、AGPAT6、LPIN1、XDH、ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因表达量下降,分别下调至50.55%（P>0.05）、61.15%（P<0.01）、84.91%（P<0.01）、89.34%（P<0.01）、21.88%（P<0.01）、86.48%（P<0.01）、25.35%（P<0.01）、27.24%（P<0.01）、41.74%（P<0.01）、22.17%（P<0.01）、62.70%（P<0.01）和70.33%（P<0.01）。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。 相似文献
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本研究参考黄牛甲状旁腺素（parathyroid hormone,PTH）基因序列设计引物,运用PCR扩增技术对水牛PTH基因进行克隆,并用生物信息学方法对序列进行分析。结果显示,成功克隆了水牛PTH基因完整编码区序列（CDS）348 bp,可编码115个氨基酸。该基因编码区序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼的同源性分别为99%、93%、91%、97%、96%和92%,表明PTH基因在不同物种间高度保守。系统进化树分析表明,水牛与黄牛PTH基因亲缘关系最近。此外,在水牛PTH基因CDS上共发现了3个碱基突变,其中两个属于同义突变,一个属于错义突变。氨基酸序列分析表明,该蛋白属于碱性、亲水、稳定型蛋白质,其分子式为C570 H941 N167 O164 S8,分子质量为13.01 ku。二级结构分析显示,水牛PTH蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主,与三级结构预测结果相一致。亚细胞定位分析显示,水牛PTH蛋白分布在细胞质（26.1%）、线粒体（21.7%）、细胞外（包括细胞壁）（17.4%）、内质网（13.0%）、细胞核（8.7%）、高尔基体（4.3%）和其他部位（8.7%）,推测PTH蛋白可能在运输、结合及细胞被膜等方面发挥信号转导和转录调控作用。 相似文献
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水牛乳汁中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
试验旨在从水牛（Bubalus bubalis）乳汁中分离培养水牛乳腺上皮细胞并对其进行鉴定,建立经济、便捷的水牛乳腺上皮细胞分离方法。通过无菌收集高产奶水牛泌乳后期乳汁,将其与PBS按2：1（V/V）混匀离心;去除上层乳脂,取带少量上清的沉淀,与PBS按上述比例混匀再次离心;将脂肪层去除干净,取沉淀上方1 mL上清及沉淀分别接种于细胞培养皿。通过细胞形态、免疫荧光、生长曲线测定、细胞接种活力、RT-PCR等对分离的细胞进行鉴定。结果表明,试验成功从水牛乳汁的上清和沉淀中分离获得了水牛乳腺上皮细胞,上清部分细胞和杂质较少;而沉淀部分则细胞和杂质较多。细胞呈典型鹅卵石样,无成纤维细胞,细胞活力好,多处于分裂期。当细胞增殖高度融合时,出现乳头状结构和分层生长现象。经免疫荧光鉴定,分离获得的水牛乳腺上皮细胞表达上皮细胞标志蛋白--细胞角蛋白18。水牛乳腺上皮细胞的生长曲线呈S型,符合一般生物学规律。细胞接种存活率的测定结果显示,细胞活力好、贴壁能力强。经RT-PCR检测,水牛乳腺上皮细胞表达乳蛋白及乳脂合成相关基因。从乳汁中分离水牛乳腺上皮细胞并对其进行鉴定,成功建立了水牛乳汁分离乳腺上皮细胞的方法,为研究水牛泌乳机制、改善乳品质、提高产奶量奠定基础。 相似文献
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本试验旨在探究脂蛋白分解酶（lipoprotein lipase, LPL）基因在水牛不同组织及泌乳期乳腺组织的表达情况,为今后研究该基因在奶水牛泌乳方面的作用提供参考。运用生物信息学方法以GenBank中黄牛LPL基因序列为模板成功克隆了水牛LPL基因完整编码序列（CDS）,并对其序列进行分析,同时使用实时荧光定量PCR技术检测LPL在水牛不同组织和不同泌乳时期中的转录水平。结果显示,水牛LPL基因CDS序列长度为1 437bp,水牛LPL亚细胞定位于细胞外（包括细胞壁）、线粒体、内质网和空泡的比例分别为55.6%、22.2%、11.1%和11.1%,说明水牛LPL主要分布在细胞外;信号肽分析结果显示,该蛋白信号肽的切割位点位于SRGGL之间,概率为0.4029;组织表达分析结果表明,水牛LPL基因在乳腺的表达量最高（P<0.01）,其他组织的表达量从高到低依次为心、输卵管、肺、脾、肾、卵巢、大肠、淋巴、子宫、胃、肝、大脑和垂体;泌乳期表达分析结果表明,LPL在D50时的乳腺组织中表达量最高(P<0.01),推测LPL在水牛泌乳盛期起重要作用。 相似文献
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为了了解水牛DDR1蛋白的生物信息学和细胞学功能，试验采用ProtParam、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL、PSORTⅡPredictio、NetPhos 3.1在线软件对水牛DDR1蛋白进行生物信息学分析，采用基因干扰的方法研究水牛DDR1基因对水牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡、基因表达和迁移的影响。结果表明：水牛DDR1蛋白由915个氨基酸组成，分子式为C4538H7029N1261O1287S43,分子量为101 222.99 u,半衰期为30 h,理论等电点为6.22,属于酸性、不稳定、可溶性蛋白质。DDR1蛋白的二级结构由256个α-螺旋(27.98%)、175个延伸链(19.13%)、55个β-折叠(6.01%)、429个无规则卷曲(46.89%)构成。亚细胞定位于内质网(44.4%)、高尔基体(33.3%)和质膜中(22.2%)中。DDR1蛋白共含有65个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点35个，苏氨酸磷酸化位点18个，酪氨酸磷酸化位点12个。D... 相似文献