Ultramicro-ELISA with a fluorogenic substrate for detection of potato viruses     

D. Reichenbächer  I. Kalinina  M. Schulze  A. Horn  H. Kleinhempel 《Potato Research》1984,27(4):353-364

Summary A double-antibody ELISA is described in which polystyrene-covered polyvinylchloride plates with 10 μl test volume in the wells are used as a solid phase. A fluorogenic substrate, 4-methylum-belliferyl phosphate is used instead of a colorigenic substrate. The plates are loaded with 10 μl samples by using a 50-channel micropipette and fluorescence units read at 0.16 mm thickness with a special measuring device. The practicability and sensitivity of the method are exemplified by the detection of potato viruses X, Y and M (secondary infections) and potato leafroll virus (primary infections), in leaf and tuber extracts. Ultramicro-ELISA is as reliable in detecting the viruses as the standard ELISA. Because of the very small volumes used in the wells, chemicals, antibodies and alkaline phosphatase are reduced by 95% as compared with the standard test.

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Zusammenfassung Es wird ein Ultramikro-ELISA in der Form eines Doppelantik?rper-ELISA (Clark & Adams, 1977) beschrieben, in dem als feste Phase polystyrolbeschichtete Polyvinylchlorid-Folien mit einem Füllvolumen von 10 μl verwendet wurden. Die Dosierung erfolgte in einem Raster von 5×10 mit einem speziellen 50-kanaligen Mikropipetter. Alle Inkubationsschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Ausspülen mit PBS-Tween wurden die Folien 20 Minuten mit Aqua dest. gewaschen. An Stelle des chromogenen Substratesp-Nitrophenylphosphat wurde 0,0005 mol/l 4-Methylumbelliferylphosphat in Diethanolaminpuffer verwendet. Die Reaktionszeit für das fluorogene Substrat betrug 20 Minuten. Ein Abstoppen der Substratreaktion entfiel, da die L?sung nach erfolgter Reaktion mit einem Mikropipetter auf eine im Raster 5×10 gekammerte Glasmessküvette überführt wurde. Die Messung der Fluoreszenzintensit?t erfolgte bei 0,16 mm Schichtdicke in einem speziellen Auswerteger?t. Dieser Ultramikro-ELISA, der zur quantitativen Bestimmung des α₁-Fetoproteins Anwendung findet (Horn et al., 1981; Hoffmann-Blume et al., 1983), wurde in seiner Nachweissicherheit mit einem üblichen Doppelantik?rper-ELISA verglichen (Richter et al., 1979). In die Untersuchungen wurden Blattpress?fte von Pflanzen einbezogen, die mit Kartoffelblattroll-Virus (PLRV), Kartoffel-Virus Y (PVY) und Kartoffel-Virus M (PVM) infiziert waren. Des weiteren wurden das Kartoffel-Virus X (PVX) sowie die Viren PVY und PVM in sekund?rinfizierten Knollen und Bl?ttern von Kartoffelzuchtst?mmen (spontane Freilandinfektionen) nachgewiesen. Zum Nachweis prim?rer Infektionen mit PLRV wurden gesunde Mutterpflanzen der Sorte Adretta an zwei Terminen mit Hilfe von Blattl?usen infiziert. Die mit beiden ELISA-Verfahren erhaltenen Ergebnisse stimmten überein. In Blattpresss?ften konnten die Viren bis zu einer Verdünnung von 10⁵ (PVM), 10³ (PVY) und 10² (PLRV) nachgewiesen werden. In 20 Individuen von Kartoffelzuchtst?mmen wurden mit beiden Verfahren übereinstimmend PVX und PVY in 5 Knollen- und Blattproben festgestellt; PVM wurde in 12 Blatt- und 13 Knollenproben nachgewiesen. Die in Blattproben ermittelten Extinktionen bzw. Fluoreszenzintensit?ten lagen um den Faktor 2–5 h?her als die Werte der Knollenextrakte. In 20 mit PLRV prim?rinfizierten Mutterpflanzen wurden im Rahmen der Blattuntersuchungen Ende Oktober mit beiden Verfahren 10 infizierte Stecklinge ermittelt. Die Ergebnisse wurden durch die Augenstecklingsprüfung, bei der 9 infizierte Pflanzen gefunden wurden, unterstützt. Bei der Untersuchung prim?rinfizierter Knollen wurde nach einer Zwischenlagerung von 2,5 Monaten in 17 von 18 dieser Knollen eine PLRV-Infektion best?tigt. Die anschliessende Augenstecklingsprüfung ergab nur 12 PLRV-infizierte Pflanzen. Eine Abh?ngigkeit vom Infektionszeitpunkt wurde nicht gefunden. Der vorgestellte Ultramikro-ELISA besitzt nach diesen Ergebnissen die gleiche Sensitivit?t wie ein üblicher Standard-ELISA. Bedingt durch die geringen Füllvolumina k?nnen jedoch Chemikalien, Antik?rper und alkalische Phosphatase um 95% der im Vergleich zum Standard ben?tigten Mengen reduziert werden.

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Résumé Dans ce travail est décrit une méthode Ultramicro-ELISA avec le principe du double anticorps-ELISA (Clark & Adams, 1977). La partie réceptrice solide se compose de feuilles en polyvinylchloride additionnée de couches en polystérole avec une capacité de 10 μl par alvéole. La sensibilisation des plaques qui correspondent à une grille de 5×10 alvéoles, est effectuée avec une micro-multipipette à 50 canaux. L'incubation a lieu à température ambiante. Après rin?age des plaques avec le PBS-Tween le lavage est effectué durant 20 minutes avec de l'eau distillée. A la place du substratp-nitrophénylphosphore on utilise une solution de 4-methylumbelliferylphosphore 0,0005 mol/l avec un tampon de diethanolamine. La durée de réaction du substrat fluorescent est de 20 minutes. Un stoppage de la réaction est superflu, étant donné qu'une fois la réaction obtenue, la solution est prélevée avec une micro pipette et versée sur une grille-cuvette en verre avec 5×10 champs. La mesure de l'intensité fluorescente est effectuée avec un appareil spécial sur une couche de 0,16 mm. Cet ELISA Ultramicro-test utilisé pour la détermination quantitative de la protéine α-1 Feto (Horn et al., 1981; Hoffmann-Blume et al., 1983) a été comparé sur sa fiabilité avec un double anticorps-ELISA courant (Richter et al., 1979). Les examens comprenaient des jus de feuilles de pommes de terre contaminées par PLRV, PVY, PVM. On a également détecté le PVX, PVY et PVM, infections secondaires de tubercules et feuilles de clones de pommes de terre. Pour la détection des infections primaires de PLRV, des plantes-mères saines de la variété Adretta ont été infectées à deux dates à l'aide de pucerons. Les résultats obtenus avec les deux méthodes ELISA concordent dans tous les essais. Dans le jus de feuilles, les virus ont été détectés jusqu'à une dilution 10⁵ (PVM), 10³ (PVY) et 10² (PLRV). Sur les 20 clones examinés on a décelé avec les deux méthodes 5 cas de PVX et PVY dans les échantillons de tubercules et feuilles. PVM a été détecté dans 12 cas sur les feuilles et 13 fois sur les tubercules. Les extinctions, c'est-à-dire les intensités fluorescentes, sont 2 à 5 fois plus élevées à partir de jus de feuilles que sur du jus de tubercules. Sur 20 plantes qui présentaient une infection primaire, on a obtenu par des analyses foliaires des boutures à fin octobre, 10 individus infectés avec chaque méthode. Ces résultats ont été confirmés par des tests d'indexage qui ont donné 9 individus infectés. Lors de la détection d'infections primaires, après entreposage des tubercules pendant 21/2 mois, on a obtenu 17 tubercules positifs sur 18 contaminés de PLRV. L'indexage d'oeilletons a permis de déceler 12 individus malades sur ce même matériel. On a pas observé de différence selon l'époque d'infection de la plante-mère. Cela avait cependant été démontré lors d'une étude plus conséquente (Richter et al., 1983). Selon les résultats obtenus avec les virus de la pomme de terre PVX, PVY et PVM d'infections secondaires, ainsi que du PLRV d'infections primaires l'ultramicro-test ELISA offre la même sensibilité que le test ELISA standard. En raison des petits volumes des plaques, les substances chimiques, anticorps et phosphatase alcaline, peuvent être réduites de 95% comparativement avec la méthode traditionnelle.

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