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飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的特性及生物学功能 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】研究飞蝗葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶（glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase,GNA）的特性及生物学功能,为探讨飞蝗表皮几丁质的合成机制及研发新型绿色环保杀虫剂提供实验依据。【方法】采用生物信息学方法,在飞蝗EST数据库中搜索GNA的cDNA序列,并与其它物种GNA序列进行同源比较;设计飞蝗GNA特异性表达引物,分析5龄第2天不同组织样品间的表达差异及5龄第1 天至第7 天表皮中GNA表达量的变化;构建pET-28a（+）蛋白表达载体,在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株中表达GNA重组蛋白,Ni柱亲和纯化重组蛋白并分析重组蛋白的酶学活性;通过RNA干扰研究GNA的生物学功能。【结果】飞蝗GNA与其它物种GNA的氨基酸序列一致性很高,结合底物GlcN6P的氨基酸残基完全一致,说明不同物种间GNA非常保守;飞蝗GNA组织特异性分析显示其在表皮、脂肪体及肌肉中表达量较高;飞蝗5龄表皮的发育变化表明,GNA在刚蜕皮后的表达量最高,之后逐步降低;飞蝗GNA重组蛋白在大肠杆菌E. coli BL21（DE3）菌株中成功表达,经过Ni-NTA柱纯化得到单一目的条带,酶学特性研究表明飞蝗GNA重组蛋白的最适反应温度为37-50℃,最适pH为8.0-9.5;测定了飞蝗重组GNA的Km值,当D-GlcN6P的浓度为200 μmol•L-1时,Acetyl-CoA的Km=133.60 μmol•L-1;当Acetyl-CoA的浓度为200 μmol•L-1时,D-GlcN6P的Km=42.43 μmol•L-1;飞蝗GNA的RNA干扰结果显示,GNA的表达能够被有效沉默,但蜕皮及发育未受影响。【结论】飞蝗GNA与其它物种的GNA氨基酸序列一致性很高;用该序列原核表达的重组蛋白具有葡萄糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶的活性;飞蝗GNA被干扰后未观察到对飞蝗蜕皮及发育产生影响,推测存在N-乙酰葡萄糖胺激酶（GlcNAc kinase）补救途径催化产生GNA的底物N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸（GlcNAc6P）,用于几丁质的合成。 相似文献
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【目的】研究稻蝗属特异性DNA分子标记,为稻蝗属物种的分类鉴定提供快速有效的分子检测方法。【方法】基于稻蝗属物种及其近缘属种的大量RAPD-PCR结果,筛选出稻蝗属物种特异性的RAPD条带,对该特异RAPD条带进行克隆、测序。基于所测序列设计特异引物,以稻蝗属不同物种和蝗总科其它物种基因组DNA为模板进行PCR扩增。【结果】随机引物S823可在稻蝗属不同物种扩增出约650bp的RAPD条带,经对该条带的克隆、测序,发现在3个受试的稻蝗属物种中序列同源度达92.3%—96.6%,序列G+C含量大于15%,并富含大量的A、T重复区;基于已知序列设计的特异引物对稻蝗属7个物种可以扩增出目的条带(550bp),而对赤胫伪稻蝗及蝗总科其它物种均无扩增条带。【结论】鉴定了稻蝗属特异的RAPD条带,基于该条带序列设计的特异引物可用于稻蝗属物种的快速分子鉴定。 相似文献
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【目的】细胞色素P450（Cytochrome P450）是昆虫体内广泛分布的代谢解毒酶系,飞蝗（Locusta migratoria）是重要农业害虫,揭示其体内P450代谢解毒功能对飞蝗有效治理尤为必要。研究旨在将飞蝗2个P450基因CYP408B1和CYP409A1分别转入果蝇（Drosophila melanogaster）体中,建立转基因果蝇品系,测定果蝇对杀虫剂的敏感性,为进一步探索飞蝗CYP408B1和CYP409A1对杀虫剂的代谢解毒功能提供依据。【方法】采用转基因技术成功构建转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的纯合果蝇品系;分别选择雄性转基因果蝇UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和亲本果蝇attp40与tub-gal4的处女果蝇杂交,提取子一代启动目的基因CYP408B1和CYP409A1表达的转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1以及对照组果蝇品系tub＞attp40的DNA和总RNA,并将RNA体外反转录为cDNA。分别以DNA和cDNA为模板,PCR方法验证转基因果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1;通过杀虫剂生物学测定,进一步分析转基因果蝇品系tub＞CYP408B1、tub＞CYP409A1以及对照组tub＞attp40、UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和attp40对溴氰菊酯、马拉硫磷和毒死蜱3种杀虫剂的敏感性;采用荧光法定量测定转基因果蝇品系tub＞CYP408B1、tub＞CYP409A1以及对照组tub＞attp40中细胞色素P450的总酶活性。【结果】PCR扩增结果显示以DNA为模板,启动目的基因表达的转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1中均可以检测到目的条带,大小分别为1 555和1 585 bp;以cDNA为模板进行RT-PCR和RT-qPCR,结果显示在转基因果蝇品系中飞蝗CYP408B1和CYP409A1均得到表达。对3种杀虫剂的生物测定结果显示转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1对溴氰菊酯的抗药性均较对照组高,且与tub＞attp40相比,抗性比分别为1.59和1.83,而对马拉硫磷和毒死蜱的抗性比并未提高。细胞色素P450总酶活性结果显示转基因果蝇品系tub＞CYP408B1和tub＞CYP409A1总酶活性与对照组tub＞attp40相比,均无显著性差异。【结论】利用转基因技术成功构建了转飞蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的果蝇品系UAS-CYP408B1和UAS-CYP409A1;飞蝗CYP408B1和CYP409A1均对溴氰菊酯具有一定的解毒功能。 相似文献
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5-氨基乙酰丙酸对中华稻蝗（Oxya chinensis）的杀虫活性及对3种酶活性的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】研究5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid,ALA）对中华稻蝗（Oxya chinensis）的杀虫活性及对3种酶活性的影响。【方法】以中华稻蝗4龄若虫为试验材料,用不同剂量的ALA（A1：250 mmol•L-1;A2：450 mmol•L-1;A3：750 mmol•L-1;A4：1 000 mmol•L-1）处理中华稻蝗,观察其对中华稻蝗的毒性效应和对其体内乙酰胆碱酯酶（AChE）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的影响。【结果】不同剂量ALA处理组中华稻蝗死亡率依处理剂量呈现上升趋势,高浓度处理组A3、A4的死亡率分别达到66.19%和80.21%;LD50值为3.61（3.29～3.93）mg•g-1虫重（95%置信范围）。生化研究结果显示,最高浓度A4处理组雌、雄虫体内AChE活性分别较对照组下降了51.53%和42.65%,差异显著（P＜0.05）;GPx活性分别较对照组下降了42.82%和43.85%,差异显著（P＜0.05）。同时,中华稻蝗GSTs活性随ALA处理剂量升高而增高,A4处理组雌、雄虫体内GSTs活性分别较对照组升高了171.05%及97.42%,差异显著（P＜0.05）。【结论】ALA对雌、雄中华稻蝗均有明显的毒性效应;ALA可引起AChE和GPx光失活,从而导致中华稻蝗神经传导受阻同时抵御氧化损伤的能力下降;高剂量ALA激活GSTs,可引发昆虫对光毒性物质的自身反馈抵御反应。 相似文献
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徐州、平山两地中华稻蝗和日本稻蝗的群体遗传关系分析 总被引：6，自引：0，他引：6
应用RAPD技术分析了江苏徐州和河北平山两地混生的中华稻蝗（Oxya chinensis）和日本稻蝗(O.japonica) 的群体遗传关系。用10条随机引物从43头个体中产生125条清晰、稳定的谱带， 其多态性条带占99%。 Shannon信息指数表明，中华稻蝗遗传多样性高于日本稻蝗，分别为0.3432和0.2781。Nei's遗传距离显示：种群间遗传距离明显小于种间遗传距离；同一采集地点混居的中华稻蝗与日本稻蝗之间的遗传距离小于地理上存在较大跨度的两物种间的遗传距离，如：江苏徐州中华稻蝗和日本稻蝗之间的遗传距离为0.2411，河北平山中华稻蝗和日本稻蝗的遗传距离为0.2578，而江苏徐州中华稻蝗和河北平山日本稻蝗之间的遗传距离为0.2749，江苏徐州日本稻蝗和河北平山中华稻蝗之间的遗传距离为0.2982。基于Nei's遗传距离，分别用UPGMA和NJ法构建分子系统树，结果供试的43个个体分为两大聚类簇，江苏徐州和河北平山两地的中华稻蝗聚为一支，日本稻蝗聚为另一支。上述结果表明，RAPD分析方法可显示个体间的多态性，反映个体或物种间的细微差异，是区分近缘物种的有效分子标记。 相似文献
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采用薄层干燥方式研究糖厂滤泥的热风干燥特性。在标准隧道式热风干燥实验装置上通过改变热风温度、流速以及滤泥滤饼的厚度进行实验,测定滤泥的失水变化,获得干燥曲线。结果表明,滤泥滤饼厚度、热风温度和热风流速均对干燥速率有重要影响。其中滤饼厚度对干燥速率影响最大;高温高速有利于提高干燥速率,但是会降低恒速干燥的临界含水分,风速对临界含水分影响不大。最适热风温度和风速分别为90℃和8m/s。滤泥在热风温度为90℃、流速为8m/s,滤饼厚度为4mm进行干燥时,其临界含水量约为干基含水量0.33。 相似文献
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MATLAB是一种影响大、流行广的科学计算语言,MATLAB的图形用户界面开发环境(GUIDE)支持外部ActiveX控件的使用,利用这一功能可以极大地扩展MATLAB界面设计的灵活性。将MATLABGUI中的ActiveX控件应用于汽车仪表盘设计,探讨ActiveX控件的使用方法和用该方法设计汽车仪表盘的简便性和可行性。 相似文献
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【目的】MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约22 nt的非编码RNA,通过转录后调控的方式在多种生命活动中发挥重要功能。Argonaute1(AGO1)蛋白作为miRNA沉默复合物(miRNA silencing complex RISC)的重要组成部分,在miRNA调控通路中起着关键作用。论文旨在研究AGO1的生物学功能及其对飞蝗(Locusta moratoria)生长发育的影响,为探索昆虫miRNA的生物合成和农业害虫的有效控制提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法在飞蝗转录组数据库中获得Lm AGO1 c DNA序列;使用在线蛋白翻译软件(Ex PASy)对Lm AGO1进行蛋白翻译,利用SMART分析Lm AGO1蛋白的功能结构域;选取家蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)等模式昆虫的同源序列与Lm AGO1氨基酸序列进行聚类分析,采用Phyml软件构建昆虫AGO蛋白的系统发育树;为了进一步研究Lm AGO1在飞蝗生长发育过程中的作用,使用T7 RiboMAX~(TM) Express RNAi System体外合成Lm AGO1的ds RNA,在飞蝗4龄第2天和5龄第2天若虫期连续两次注射ds RNA进行干扰,同时注射ds GFP作为对照。分别收集注射ds RNA后48 h和72 h的整虫样品提取RNA,反转录为c DNA。通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测Lm AGO1在不同时间点的干扰效率并观察虫体的发育表型。同时,为了检测Lm AGO1沉默是否会影响miRNA的生物合成,采用RT-q PCR对飞蝗体内5个高丰度miRNA表达进行定量分析。【结果】Lm AGO1蛋白含845个氨基酸,具有典型的AGO蛋白家族保守结构域,即位于213—348位点的PAZ结构域和502—804位点的PIWI结构域。聚类分析表明,Lm AGO1蛋白与其他昆虫的AGO1蛋白聚为一类。通过AGO1氨基酸序列同源比对结果显示Lm AGO1与模式昆虫果蝇、家蚕AGO1的氨基酸序列一致度高达82.2%和86.9%。RNAi结果表明,虫体注射ds Lm AGO1 48 h和72 h后,与对照组相比,Lm AGO1表达量均显著降低,干扰效率分别为88.1%和93.0%;进一步观察试虫生长发育的表型特征,与对照组相比,飞蝗4龄期注射dsL m AGO1后其生长发育并没有出现明显异常,待蜕皮发育至下一龄期(即5龄期)时,出现大量死亡,死亡率为89.3%;荧光定量PCR结果显示注射ds Lm AGO148 h后,飞蝗体内miRNA-252和miRNA-8的表达显著下降,干扰72 h后miRNA-7、let 7、miRNA-252、miRNA-8的表达均显著下降。【结论】飞蝗AGO1除参与RSIC的形成以外,还可能参与miRNA的剪切加工过程进而调控飞蝗的正常发育。 相似文献
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飞蝗表皮蛋白Obstructor家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析 总被引：1，自引：1，他引：0
【目的】获得飞蝗（Locusta migratoria）表皮蛋白Obstructor（Obst）家族基因的cDNA序列,并研究其序列特征和mRNA表达特性,探讨其生物学功能,为害虫防治提供新的分子靶标。【方法】采用生物信息学方法搜索飞蝗转录组数据库获得Obst家族基因cDNA片段,并进行BLAST分析得到Obst家族基因的cDNA序列;采用RACE技术扩增该家族基因的3′cDNA序列,拼接后获得全长;SignalP在线软件分析蛋白的信号肽,SMART网站预测其功能域,并使用Mega 5.10软件中Neighbor-Joining方法,与黑腹果蝇（Drosophila melanogasterObst家族基因和赤拟谷盗（Tribolium castaneumCPAP3家族基因（Obst家族基因的同源基因）氨基酸序列进行聚类分析;采用real-time quantitative PCR（qPCR）方法检测LmObst家族基因在5龄若虫不同组织部位和不同龄期体壁的表达情况,绘制表达图谱））;采用RNA干扰（RNAi）技术探讨LmObsts对飞蝗发育的影响。【结果】在飞蝗转录组数据库中搜索得到8个Obst家族基因的cDNA片段,通过NCBI进行BLAST分析显示与赤拟谷盗CPAP3、黑腹果蝇Obst高度同源,属于LmObst家族基因片段,其中5个是全长序列,3个序列缺失3′端;采用RACE技术获得3′末端cDNA序列;将得到的8个LmObst家族基因全长序列进行功能域分析,发现具有Obst家族表皮蛋白的特点,即有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;并与黑腹果蝇、赤拟谷盗同源基因进行进化树的构建,根据进化树分析结果,分别命名为LmObst-A1、LmObst-A2、LmObst-B、LmObst-C、LmObst-D1、LmObst-D2、LmObst-E1和LmObst-E2。qPCR结果显示LmObst-E1和LmObst-E2在前肠和后肠高特异性表达,LmObst-D1在体壁和前肠高表达,其他LmObsts在体壁或外胚层内陷形成的前肠和后肠高表达,在胃盲囊、中肠、马氏管和脂肪体中低表达;LmObst家族基因在5龄若虫不同天数体壁的表达趋势比较接近,在5龄前期高表达,中期降到最低,蜕皮前又上升到高水平。采用RNAi技术研究基因的生物学功能,5龄若虫第5天分别注射dsLmObst,对照组注射等量dsGFP,48 h后检测沉默效率,发现目的基因表达量显著降低;进一步观察发现,注射dsLmObst-E1的5龄若虫80%无蜕皮迹象,在5龄若虫状态下死亡,剩余20% 若虫蜕皮延迟1-2 d,并且蜕至成虫后,16 h内全部死亡;其余注射双链的试虫普遍发生蜕皮延迟1-3 d的现象,但未发现其他可见的异常表型。【结论】获得8个飞蝗LmObst家族基因,所有Obst家族蛋白功能域保守,均有1个信号肽与3个几丁质结合域ChtBD2;LmObsts主要参与飞蝗体壁和前、后肠等外胚层发育来源组织器官的形成。LmObst-E1是飞蝗发育所必需的,该基因沉默可导致飞蝗死亡,其他7个LmObsts的沉默导致飞蝗发育延迟1-3 d,但无致死效应。 相似文献