Ⅵ型分泌系统与革兰氏阴性病原细菌致病性的关系     

张丽勍  许景升  徐进  冯洁 《植物保护》2011,37(3):7-11

细菌在长期进化过程中形成了设计精巧的蛋白传输系统,运送与寄主互作过程中产生的各种与致病有关的毒性因子和效应子。目前已发现在细菌基因组中至少存在6种不同类型的分泌系统。本文着重介绍新近发现的Ⅵ型分泌系统及其与革兰氏阴性病原细菌致病性的关系。  相似文献   

PMA-qPCR定量检测青枯菌活菌方法的建立     

王帅  徐进  许景升  张昊  冯洁 《植物保护》2018,44(6):122-128

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与荧光实时定量PCR技术相结合,建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为15 ng/μL,黑暗孵育时间为10 min,曝光时间为5 min的PMA预处理体系。试验结果表明,当活菌比例大于10%,PMA-qPCR的测定结果均在理论活菌数相对应的95%置信区间内。检测灵敏度测试结果显示,该方法适用于活菌数在5.0×10~2～5.0×10~8 cfu/mL范围内菌悬液的检测。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除青枯菌死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性青枯病的流行规律研究提供新的技术支撑。  相似文献   

植物青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统中hcp基因的克隆及其功能研究     

宋莎莎  徐进  许景升  陈匡宇  张丽勍  张昊  冯洁 《植物保护》2012,38(5):16-21

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是新近报道的细菌蛋白分泌系统。基于植物青枯菌致病力分化菌株Po82的全基因组测序结果,发现其大质粒中存在T6SS的同源基因簇。本文通过基因敲除的方法构建了Po82菌株Ⅵ型分泌系统中的核心基因—hcp基因的缺失突变株,并比对了Po82野生型菌株、突变株及互补菌株在致病性、生长速率、运动性、生物膜形成等方面的变化。结果表明,hcp基因突变株较野生型菌株致病力显著减弱,病程延长;在生长速率、运动性及生物膜形成方面,突变株较野生型无明显差异。说明植物青枯菌Po82菌株T6SS中的hcp基因参与了细菌的致病过程。  相似文献   

植物青枯菌LAMP检测方法的建立   总被引：5，自引：0，他引：5  

黄雯  徐进  张昊  许景升  丁伟  冯洁 《中国农业科学》2016,49(11):2093-2102

【目的】由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum,简称青枯菌）引起的青枯病（bacterial wilt of plants）是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一,严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术,是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的lpxC基因序列,并利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0得到4条LAMP特异性引物,F3（5′- CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′）、B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）、FIP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT -3′）、BIP（5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）。通过单因素变化试验对LAMP反应体系中的各参数进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,设置镁离子浓度为2、4、6、8、10、12 mmol·L^-1,设置内外引物浓度比为2﹕1、4﹕1、6﹕1、8﹕1、10﹕1、12﹕1,确定最优反应体系。以分离自不同寄主的24个青枯菌株为参试对象,5个非青枯菌株（Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia）为对照,验证LAMP检测方法的特异性。将青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA进行10倍梯度系列稀释,以原液和10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍的稀释液为模板同步进行LAMP和普通PCR检测,比较两者的检测灵敏度。将马铃薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分别与马铃薯块茎和生姜根茎组织悬浮液混合,以LAMP检测方法对混合物进行检测,并以同样方法对表现典型萎蔫症状的人工接种番茄植株和健康植株以及田间马铃薯罹病块茎样品进行检测。反应结果直接通过观察产生的白色焦磷酸镁沉淀情况进行判定,或通过加入1 μL SYBR GreenⅠ荧光染料进行观察,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。【结果】建立了特异性检测青枯菌的LAMP方法,优化后确立了检测体系中FIP/BIP与F3/B3的浓度比为8﹕1（1.6﹕0.2 μmol·L^-1）,镁离子浓度为6 mmol·L^-1,反应温度为63℃。特异性检测结果显示,仅参试青枯菌反应管中的反应液呈现绿色,表明建立的检测体系具有高度特异性。以青枯菌GMI1000菌株的DNA原液及不同梯度的稀释液为模板进行的LAMP和普通PCR检测结果显示,LAMP的检测灵敏度为1.42 pg,比普通PCR高10倍。能够快速准确地从植物组织悬浮液、罹病番茄植物组织及田间罹病样品中检测到青枯菌。【结论】建立的青枯菌LAMP检测方法,高效特异,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果,适合基层和现场检测。  相似文献   

黄淮麦区假禾谷镰刀菌对3种杀菌剂敏感性测定     

王季锋#  王珊珊  #  许景升  徐进  冯洁  张爱香  田海月  王连刚  黄俊霞  张昊 《植物保护》2023,49(3):333-337

以假禾谷镰刀菌Fusarium pseudograminearum为主要病原菌引起的小麦茎基腐病已经成为黄淮麦区的主要小麦病害之一,对小麦生产安全带来严重威胁。为了解假禾谷镰刀菌对氰烯菌酯、戊唑醇和咯菌腈3种杀菌剂的敏感性,采用菌丝生长速率法对采自河南、河北、山东的108株假禾谷镰刀菌进行了室内毒力测定。试验结果表明：氰烯菌酯对假禾谷镰刀菌的EC₅₀为0.088～0.929μg/mL,EC₅₀均值为(0.471±0.181)μg/mL;敏感性分布为连续单峰曲线,经Shapiro-Wilk正态性检验符合正态分布(W=0.988,P=0.437>0.05),所以将所有菌株的EC₅₀平均值0.471μg/mL定为假禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的敏感基线;戊唑醇对供试菌株的EC₅₀为0.015～0.961μg/mL,EC₅₀均值为(0.384±0.219)μg/mL,敏感性分布不符合连续单峰的正态分布;咯菌腈对供试菌株的EC₅₀为0.029～0.354μg/mL,E...  相似文献   

应用抑制性差减杂交法筛选植物青枯菌致病相关基因   总被引：3，自引：0，他引：3  

刘蕾  徐进  许景升  张丽勍  张昊  冯洁 《农业生物技术学报》2012,(7):745-755

植物青枯菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化菌株 Po82 兼具 2 号小种和 NPB(非香蕉致病)菌株的致病特征。为了研究该菌株致病力分化机理,本实验以 Po82 为待测菌株,构建了抑制性差减杂交文库。建库质量分析结果表明,具有较高的接头连接以及文库构建效率,插入片段平均长度为 300 bp,文库构建质量较好。对文库中随机挑取阳性克隆进行测序,共筛选出 44 个 Po82 菌株差异基因。生物信息学分析结果表明,所得差异基因主要涉及新陈代谢、转座酶、膜结构、分泌蛋白、毒力、转录因子以及未知功能等。利用基因敲除技术对其中的 c00283 基因功能进行了研究,结果表明,该基因在 Po82 菌株致病过程中起重要作用。半定量 RT-PCR 结果表明,c00283 基因在 hrp 诱导培养基中的表达情况与 hrpB 基因一致,初步确定其为Ⅲ型分泌系统效应子。基础生物学实验结果表明,该基因对 Po82 菌株的生长、生物膜形成及运动性没有影响。青枯菌 Po82 菌株抑制性差减杂交文库的构建及致病相关基因的功能分析,为后续致病力分化的分子机理研究提供基础材料。  相似文献   

适用于镰刀菌基因敲除和荧光融合蛋白表达的高效通用载体的构建     

王晓亮  张昊  潘逸  许景升  徐进  冯洁 《植物保护》2014,40(3):106-112

本文通过使用USER酶克隆技术,构建一系列用于镰刀菌基因敲除和荧光融合蛋白表达,并且操作简单快速的通用载体。在hph基因两侧引入USER酶特异位点,构建了基因敲除载体pKH-KO,可以一步在hph的两侧同时插入上下游同源重组片段;在gfp基因5′端引入USER位点构建了荧光融合蛋白表达载体pKHGFPE和pKNGFPE。此方法构建的载体在插入目的片段时均不用考虑酶切位点,极大地方便了试验设计,并且步骤简单,操作简便,节约大量时间。在大规模进行基因敲除以及相关蛋白定位等基因功能研究上具有广阔的应用前景。  相似文献   

PMA-PCR方法快速检测VBNC状态青枯菌   总被引：1，自引：0，他引：1  

于小龙  徐进  张昊  许景升  黄雯  胡晓梅  冯洁  王学利 《植物保护》2016,42(1):144-149

青枯菌为应对逆境胁迫,可进入活的但非可培养状态(viable but non-culturable,VBNC)。本文利用叠氮溴化丙锭(PMA)与PCR技术相结合,建立了一种快速有效区分青枯菌死活细胞的分子检测方法。基于hrcS基因序列,设计了一对青枯菌种特异性检测引物hrcSf/hrcSr;利用PMA对青枯菌Po82菌株的细胞悬浮液样品进行预处理,随后进行常规PCR扩增。结果表明,当样品中PMA质量浓度为3μg/mL、曝光时间大于5min时,PMA可有效抑制死亡菌体细胞中的DNA扩增;且对可培养和VBNC状态细胞中的DNA扩增没有影响;本试验建立的PMA-PCR方法能有效对包括VBNC状态在内的青枯菌活菌进行检测,避免了假阳性与假阴性结果的产生。  相似文献   

青枯菌Po82菌株Ⅵ型分泌系统基因簇功能研究     

罗亚婷  许景升  徐进  张昊  冯洁 《植物保护》2016,42(6):38-45

Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)是革兰氏阴性细菌中新近发现的分泌系统,控制细菌的毒性和蛋白泌出。本试验构建了植物青枯菌Po82菌株的T6SS基因簇完全缺失菌株,从全局水平初步分析了T6SS的功能。与野生型菌株相比,T6SS基因簇的缺失导致了突变菌株运动能力显著增强,在接种前期突变株病情指数明显下降;通过qRT-PCR分析Ⅲ型分泌系统效应子基因,其中popA、popB和popP基因表达量上调,而popC表达水平下调。T6SS基因簇的缺失影响了Po82菌株的运动能力和Ⅲ型效应子基因的表达,使得Po82病程延长。这些结果说明,T6SS参与青枯菌的致病过程,且T6SS与T3SS之间有复杂的未知调控关系。  相似文献   

用基因芯片技术分析水稻白叶枯病菌侵染过程的基因表达图谱   总被引：2，自引：0，他引：2  

张新建  许景升  何晨阳 《植物病理学报》2005,(Z1)

水稻白叶枯病是由水稻黄单胞细菌(Xan- thomonas oryzae pv．oryzae,简称Xoo)侵染引起的。对Xoo致病机理的研究已从传统生物学、生理生化学逐渐向分子生物学以及新近发展起来的基因组学方向发展。已经从Xoo中克隆和定性了 vir、avr、hrp等几十个致病相关基因,对这些基因结构和功能的研究,在一定程度上增加了对Xoo 与水稻互作分子基础的认识。然而,病原菌致病过程是一个极其复杂的过程,病原菌需要侵入寄主, 避开寄主的防卫反应,摄取营养,形成有效定殖。这一过程不是一个或几个基因产物所能完成的,而是需要大量的毒性因子在特定的时间、空间进行特异水平的表达,才能实现成功的侵染。为了全面认清病菌的致病机理,仅仅对单个基因的功能进行研究显然是不够的,还需要从整个基因组水平上了解  相似文献